लाइम रोग स्पाइरोकेट बोरेलिया बर्गडोरफेरी के फेज-मध्यस्थता आनुवंशिक हेरफेर
Summary
जीवाणु कोशिकाओं के बीच डीएनए को स्थानांतरित करने के लिए बैक्टीरियोफेज की क्षमता उन्हें अपने जीवाणु मेजबानों के आनुवंशिक हेरफेर के लिए प्रभावी उपकरण बनाती है। यहां प्रस्तुत लाइम रोग स्पाइरोकेट के विभिन्न उपभेदों के बीच हेटरोलॉगस डीएनए को ट्रांसड्यूस करने के लिए बोरेलिया बर्गडोर्फेरी के एक बैक्टीरियोफेज, एबीबी -1 को प्रेरित करने, ठीक करने और उपयोग करने के लिए एक पद्धति है।
Abstract
स्पाइरोकेट बोरेलिया बर्गडोरफेरी में विदेशी डीएनए का परिचय लगभग विशेष रूप से इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके परिवर्तन द्वारा पूरा किया गया है। इस प्रक्रिया में अन्य, बेहतर विशेषता वाले ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के सापेक्ष लाइम रोग स्पाइरोकेट में विशेष रूप से कम क्षमता है। परिवर्तन की सफलता की दर विशिष्ट पृष्ठभूमि से उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए की केंद्रित मात्रा पर अत्यधिक निर्भर है और महत्वपूर्ण तनाव-से-तनाव परिवर्तनशीलता के अधीन है। बर्गडोर्फेरी में विदेशी डीएनए (यानी, शटल वैक्टर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर) को पेश करने के लिए वैकल्पिक साधन लाइम रोग स्पाइरोकेट के आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपयोगी उपकरणों के आयुध के लिए एक महत्वपूर्ण अतिरिक्त हो सकता है। ट्रांसडक्शन नामक प्रक्रिया में बैक्टीरिया के बीच डीएनए के आंदोलन के लिए प्राकृतिक तंत्र के रूप में बैक्टीरियोफेज को अच्छी तरह से मान्यता दी गई है। इस अध्ययन में, एक ही और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि दोनों के बी बर्गडोर्फरी कोशिकाओं के बीच डीएनए को ट्रांसड्यूस करने के लिए सर्वव्यापी बोरेरियल फेज एबबी -1 का उपयोग करने के लिए एक विधि विकसित की गई है। ट्रांसड्यूस्ड डीएनए में छोटे शटल वैक्टर के रूप में बोरेरियल डीएनए और हेटरोलॉगस डीएनए दोनों शामिल हैं। यह प्रदर्शन लाइम रोग स्पाइरोकेट के आनुवंशिक हेरफेर के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के पूरक के रूप में फेज-मध्यस्थता पारगमन के संभावित उपयोग का सुझाव देता है। यह रिपोर्ट बी बर्गडोर्फेरी से फेज एबीबी -1 के प्रेरण और शुद्धिकरण के तरीकों का वर्णन करती है, पारगमन परख में इस फेज का उपयोग, और संभावित ट्रांसडक्टेंट्स के चयन और स्क्रीनिंग।
Introduction
स्पाइरोकेटल जीवाणु बोरेलिया बर्गडोरफेरी के आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपकरणों के विकास ने लाइम रोग 1,2,3,4 की प्रकृति की समझ में अथाह मूल्य जोड़ा है। बर्गडॉर्फेरी में एक असामान्य रूप से जटिल जीनोम होता है जिसमें एक छोटा रैखिक गुणसूत्र और रैखिक और परिपत्र प्लास्मिड 5,6 दोनों होते हैं। सहज प्लास्मिड हानि, इंट्राजेनिक पुनर्व्यवस्था (एक ही जीव के भीतर एक प्लास्मिड से दूसरे में जीन की गति), और क्षैतिज जीन स्थानांतरण (एचजीटी, दो जीवों के बीच डीएनए की गति) ने बी बर्गडोरफेरी के बीच आनुवंशिक विषमता की एक बड़ी मात्रा को जन्म दिया है (उदाहरण के लिए, देखें शुत्ज़र एट अल।7)। परिणामी जीनोटाइप (या “उपभेद”) सभी एक ही प्रजाति के सदस्य हैं, लेकिन आनुवंशिक अंतर हैं जो विभिन्न स्तनधारीमेजबानों को संचारित करने और संक्रमित करने की उनकी क्षमता को प्रभावित करते हैं। इस रिपोर्ट में, “तनाव” शब्द का उपयोग एक विशेष प्राकृतिक रूप से व्युत्पन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ बी बर्गडॉर्फेरी को संदर्भित करने के लिए किया जाएगा; “क्लोन” शब्द का उपयोग एक तनाव को संदर्भित करने के लिए किया जाएगा जिसे आनुवंशिक रूप से किसी विशेष उद्देश्य के लिए या प्रयोगात्मक हेरफेर के परिणामस्वरूप संशोधित किया गया है।
बर्गडोरफेरी में उपयोग के लिए उपलब्ध आणविक टूलबॉक्स में चयन योग्य मार्कर, जीन रिपोर्टर, शटल वैक्टर, ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस, इंड्यूसेबल प्रमोटर और काउंटर-सेलेक्शनेबल मार्कर शामिल हैं (समीक्षा के लिए, ड्रेकट्राह और सैमुअल्स12 देखें)। इन पद्धतियों के प्रभावी उपयोग के लिए बी बर्गडोरफेरी स्ट्रेन में हेटरोलॉगस (विदेशी) डीएनए के कृत्रिम परिचय की आवश्यकता होती है। बर्गडोरफेरी में, हेटरोलॉगस डीएनए की शुरूआत लगभग विशेष रूप से इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से प्राप्त की जाती है, एक विधिजो मीडिया में पेश किए गए डीएनए के छोटे टुकड़ों के लिए बैक्टीरिया झिल्ली को क्षणिक रूप से पारगम्य बनाने के लिए बिजली की पल्स का उपयोग करती है। अधिकांश कोशिकाएं (अनुमानित ≥99.5%) नाड़ी द्वारा मार दी जाती हैं, लेकिन शेष कोशिकाओं में हेटरोलॉगस डीएनए13 को बनाए रखने की उच्च आवृत्ति होती है। हालांकि बैक्टीरिया में डीएनए को पेश करने के सबसे अधिक कुशल तरीकों में से एक माना जाता है, बी बर्गडॉर्फेरी में इलेक्ट्रोपोरेशन की आवृत्ति बहुत कम है (5 में 1 ट्रांसफॉर्मेंट से 1 × 104 से 5 × 106 कोशिकाओं तक)13। परिवर्तन की उच्च आवृत्तियों को प्राप्त करने के लिए बाधाएं तकनीकी और जैविक दोनों प्रतीत होती हैं। बी. बर्गडोरफेरी के सफल विद्युतीकरण के लिए तकनीकी बाधाओं में डीएनए की मात्रा (>10 डिग्री) शामिल है जो आवश्यक है और इलेक्ट्रोकॉम्पिटेंट कोशिकाओं को तैयार करते समय स्पाइरोकेट्स की बिल्कुल सही विकास चरण (मध्य-लॉग, 2 × 107 सेल-एमएल-1 और 7 × 107 सेल-एमएल -1) में होने की आवश्यकता शामिल है। हालांकि, इन तकनीकी बाधाओं को जैविक बाधाओं की तुलना में दूर करना आसान हो सकता है।
लाइम रोग शोधकर्ताओं का मानना है कि बी बर्गडोर्फेरी क्लोन कोआनुवंशिक रूप से हेरफेर करने की उनकी क्षमता के संबंध में दो व्यापक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है। उच्च मार्ग, प्रयोगशाला-अनुकूलित आइसोलेट्स अक्सर आसानी से रूपांतरित हो जाते हैं, लेकिन आमतौर पर संक्रामकता के लिए आवश्यक प्लास्मिड खो देते हैं, शारीरिक रूप से असामान्य तरीके से व्यवहार करते हैं, और स्तनधारी मेजबान को संक्रमित करने या टिक वेक्टर12,13 के भीतर बने रहने में सक्षम नहीं होते हैं। जबकि ये क्लोन प्रयोगशाला के भीतर स्पाइरोकेट के आणविक जीव विज्ञान को विच्छेदित करने के लिए उपयोगी रहे हैं, वे एन्ज़ोटिक चक्र के जैविक संदर्भ में स्पाइरोकेट का अध्ययन करने के लिए बहुत कम मूल्य के हैं। दूसरी ओर, कम-मार्ग वाले संक्रामक आइसोलेट्स, एक संक्रामक अवस्था को प्रतिबिंबित करने वाले शारीरिक तरीके से व्यवहार करते हैं और संक्रामक चक्र को पूरा कर सकते हैं, लेकिन आमतौर पर हेटरोलॉगस डीएनए की शुरूआत के लिए उद्दंड होते हैं और इसलिए, अध्ययन12,13 के लिए हेरफेर करना मुश्किल होता है। कम-मार्ग आइसोलेट्स को बदलने में कठिनाई कम से कम दो अलग-अलग कारकों से संबंधित है: (i) कम-मार्ग आइसोलेट्स अक्सर एक साथ कसकर झुरमुट करते हैं, विशेष रूप से इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए आवश्यक उच्च घनत्व वाली स्थितियों के तहत, इस प्रकार कई कोशिकाओं को या तो विद्युत आवेश के पूर्ण अनुप्रयोग या मीडिया में डीएनए तक पहुंच से अवरुद्ध करता है; बर्गडोर्फेरी कम से कम दो अलग-अलग प्लास्मिड-जनित प्रतिबंध-संशोधन (आर-एम) प्रणालियों को एन्कोड करता है जो उच्च-मार्ग आइसोलेट्स14,16 में खो सकते हैं। आर-एम सिस्टम बैक्टीरिया को विदेशी डीएनए17 को पहचानने और खत्म करने की अनुमति देने के लिए विकसित हुए हैं। दरअसल, बी बर्गडोर्फेरी में कई अध्ययनों से पता चला है कि परिवर्तन क्षमता तब बढ़ जाती है जब डीएनए का स्रोत एस्चेरिचिया कोलाई13,16 के बजाय बी बर्गडोर्फेरी होता है। दुर्भाग्य से, बी बर्गडॉर्फेरी से इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए डीएनए की अपेक्षित उच्च सांद्रता प्राप्त करना एक महंगी और समय लेने वाली संभावना है। इलेक्ट्रोपोरेटिंग और कम-मार्ग आइसोलेट्स का चयन करते समय एक और संभावित चिंता यह है कि यह प्रक्रिया उन ट्रांसफॉर्मेंट्स का पक्ष लेती है जिन्होंने महत्वपूर्ण विषाणु से जुड़े प्लास्मिड, एलपी 25 14,18,19 को खो दिया है; इस प्रकार, इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से कम-मार्ग बी बर्गडोरफेरी आइसोलेट्स को आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने का कार्य उन क्लोनों के लिए चयन कर सकता है जो एन्ज़ोटिक चक्र20 के भीतर जैविक रूप से प्रासंगिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इन मुद्दों को देखते हुए, एक प्रणाली जिसमें हेटरोलॉगस डीएनए को उच्च-मार्ग बी बर्गडॉर्फेरी क्लोन में इलेक्ट्रोट्रांसफॉर्म किया जा सकता है और फिर इलेक्ट्रोपोरेशन के अलावा किसी अन्य विधि द्वारा कम-मार्ग संक्रामक आइसोलेट्स में स्थानांतरित किया जा सकता है, लाइम रोग स्पाइरोकेट में उपयोग के लिए उपलब्ध आणविक उपकरणों के बढ़ते संग्रह के लिए एक स्वागत योग्य अतिरिक्त हो सकता है।
परिवर्तन (नग्न डीएनए का उत्थान) के अलावा, दो अन्य तंत्र हैं जिनके द्वारा बैक्टीरिया नियमित रूप से हेटरोलॉगस डीएनए लेते हैं: संयुग्मन, जो एक दूसरे के साथ सीधे शारीरिक संपर्क में बैक्टीरिया के बीच डीएनए का आदान-प्रदान है, और पारगमन, जो एक बैक्टीरियोफेज21 द्वारा मध्यस्थता डीएनए का आदान-प्रदान है। दरअसल, एचजीटी को मध्यस्थ करने के लिए बैक्टीरियोफेज की क्षमता का उपयोग कई जीवाणु प्रणालियों22,23,24 के भीतर आणविक प्रक्रियाओं को विच्छेदित करने के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में किया गया है। बर्गडॉर्फेरी नग्न डीएनए के उत्थान के लिए स्वाभाविक रूप से सक्षम नहीं है, और इस बात के बहुत कम सबूत हैं कि बी बर्गडोर्फरी सफल संयुग्मन को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक तंत्र को एन्कोड करता है। हालांकि, पिछली रिपोर्टों में बी बर्गडॉर्फेरी25,26,27,28 के समशीतोष्ण बैक्टीरियोफेज एबीबी -1 की पहचान और प्रारंभिक लक्षण वर्णन का वर्णन किया गया है। बीबीबी -1 बी बर्गडोरफेरी25 के भीतर पाए जाने वाले 30 केबी प्लास्मिड के एक परिवार को पैकेज करता है; इस परिवार के सदस्यों को cp32 नामित किया गया है। बी. बर्गडोरफेरी उपभेदों के बीच एचजीटी में भाग लेने में एबीबी -1 की भूमिका के अनुरूप, स्टीवेन्सन एट अल ने दो उपभेदों में पाए गए एक समान सीपी 32 की सूचना दी, जो इन दो उपभेदों के बीच इस सीपी 32 के हालिया साझाकरण का सुझाव देता है, संभवतः पारगमन29 के माध्यम से। अपेक्षाकृत स्थिर जीनोम 30,31,32,33 में सीपी32 के बीच एचजीटी के माध्यम से महत्वपूर्ण पुनर्संयोजन के सबूत भी हैं। अंत में, एक ही तनाव की कोशिकाओं के बीच और दो अलग-अलग उपभेदों की कोशिकाओं के बीच सीपी 32 और हेटरोलॉगस शटल वेक्टर डीएनए दोनों को ट्रांसड्यूस करने के लिए एबीबी -1 की क्षमता पहले27,28 प्रदर्शित की गई है। इन निष्कर्षों को देखते हुए, बी बर्गडॉर्फेरी के आणविक जीव विज्ञान के विच्छेदन के लिए विकसित किए जाने वाले एक अन्य उपकरण के रूप में एबीबी -1 प्रस्तावित किया गया है।
इस रिपोर्ट का लक्ष्य बी बर्गडोर्फेरी से फेज एबीबी -1 को प्रेरित करने और शुद्ध करने के लिए एक विधि का विस्तार करना है, साथ ही साथ बी बर्गडॉर्फेरी क्लोन के बीच पारगमन परख करने और संभावित ट्रांसडक्टेंट्स का चयन और स्क्रीनिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्रांसडक्शन का उपयोग बी बर्गडॉर्फेरी 1,4,13,37 के इलेक्ट्रोट्रांसफॉर्म से जुड़े कम से कम कुछ जैविक और तकनीकी बाधाओं पर काबू पाने की एक विधि का प्रतिनिधित्व कर सकता<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
स्कॉट सैमुएल्स और पैट्रिक सेकोर को उनकी उपयोगी चर्चा के लिए और वेरोन (पाम) चोनवेरावोंग को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहता है। इस काम को बायोमेडिकल साइंसेज विभाग और क्विनिपियाक विश्वविद्यालय में स्कूल ऑफ हेल्थ साइंसेज से क्रिश्चियन एच एगर्स को संकाय अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
| 15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
| 5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
| 50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| Absolute ethanol | |||
| Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
| CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
| Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
| Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
| N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
| Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
| Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
| Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
| Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |
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