Fagmediert genetisk manipulasjon av Lyme-sykdommen Spirochete Borrelia burgdorferi

Summary

Bakteriofagens evne til å flytte DNA mellom bakterieceller gjør dem til effektive verktøy for genetisk manipulering av deres bakterielle verter. Presentert her er en metode for å indusere, gjenopprette og bruke φBB-1, en bakteriofag av Borrelia burgdorferi, for å transdusere heterologt DNA mellom forskjellige stammer av Lyme-sykdommen spirochete.

Abstract

Innføring av fremmed DNA i spiroketen Borrelia burgdorferi har nesten utelukkende blitt oppnådd ved transformasjon ved hjelp av elektroporering. Denne prosessen har betydelig lavere effektivitet i Lyme sykdom spirochete i forhold til andre, bedre karakteriserte Gram-negative bakterier. Suksessraten for transformasjon er svært avhengig av å ha konsentrerte mengder DNA av høy kvalitet fra spesifikke bakgrunner og er gjenstand for betydelig belastning-til-belastningsvariabilitet. Alternative midler for å introdusere utenlandsk DNA (dvs. skyttelvektorer, fluorescerende reportere og antibiotikaresistensmarkører) i B. burgdorferi kan være et viktig tillegg til armamentarium av nyttige verktøy for genetisk manipulering av Lyme-sykdommen spirochete. Bakteriofag har blitt anerkjent som naturlige mekanismer for bevegelse av DNA blant bakterier i en prosess som kalles transduksjon. I denne studien er det utviklet en metode for å bruke den allestedsnærværende borreliale fagen φBB-1 for å transdusere DNA mellom B. burgdorferi-celler med både samme og forskjellig genetisk bakgrunn. Det transduserte DNA inkluderer både borrelialt DNA og heterologt DNA i form av små skyttelvektorer. Denne demonstrasjonen antyder en potensiell bruk av fagmediert transduksjon som et supplement til elektroporering for genetisk manipulering av Lyme-sykdommen spirochete. Denne rapporten beskriver metoder for induksjon og rensing av φBB-1 fra B. burgdorferi, bruk av denne fagen i transduksjonsanalyser, og valg og screening av potensielle transduktanter.

Introduction

Utviklingen av verktøy for genetisk manipulering av spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tilført umåtelig verdi til forståelsen av Lyme-sykdommens natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har et uvanlig komplekst genom som består av et lite lineært kromosom og både lineære og sirkulære plasmider ^5,6. Spontant plasmidtap, intragen omorganisering (bevegelse av gener fra ett plasmid til et annet i samme organisme) og horisontal genoverføring (HGT, bevegelse av DNA mellom to organismer) har gitt opphav til en svimlende mengde genetisk heterogenitet blant B. burgdorferi (for eksempel, se Schutzer et ^al.7). De resulterende genotypene (eller “stammer”) er alle medlemmer av samme art, men har genetiske forskjeller som påvirker deres evne til å overføre til og infisere forskjellige pattedyrverter 8,9,10,11. I denne rapporten vil begrepet “stamme” bli brukt til å referere til B. burgdorferi med en bestemt naturlig avledet genetisk bakgrunn; Begrepet “klone” vil bli brukt til å referere til en stamme som er genetisk modifisert for et bestemt formål eller som følge av eksperimentell manipulasjon.

Den molekylære verktøykassen som er tilgjengelig for bruk i B. burgdorferi inkluderer valgbare markører, genreportere, skyttelvektorer, transposon mutagenese, induserbare promotorer og motvalgbare markører (for en gjennomgang, se Drektrah og Samuels¹²). Effektiv bruk av disse metodene krever kunstig innføring av heterologt (utenlandsk) DNA i en B. burgdorferi-stamme av interesse. I B. burgdorferi oppnås innføringen av heterologt DNA nesten utelukkende via elektroporering, en metode som benytter en puls av elektrisitet for å gjøre en bakteriemembran forbigående gjennomtrengelig for små biter av DNA introdusert i media¹. Flertallet av cellene (estimert til å være ≥99,5%) blir drept av pulsen, men de resterende cellene har en høy frekvens for å beholde det heterologe DNA¹³. Selv om det anses å være blant de mest effektive metodene for å introdusere DNA i bakterier, er hyppigheten av elektroporering i B. burgdorferi svært lav (fra 1 transformant i 5 × 10⁴ til 5 × 10⁶ celler)¹³. Barrierene for å oppnå høyere transformasjonsfrekvenser ser ut til å være både tekniske og biologiske. Tekniske barrierer for vellykket elektroporering av B. burgdorferi inkluderer både mengden DNA (>10 μg) som er nødvendig og kravet om at spiroketene skal være i nøyaktig riktig vekstfase (midt i loggen, mellom 2 × 10 7 celler · ml ^{− 1} og 7 × 10⁷ celler · ml ⁻¹) ved fremstilling av elektrokompetente celler^12,13. Disse tekniske barrierene kan imidlertid være lettere å overvinne enn de biologiske barrierene.

Lyme sykdom forskere erkjenner at B. burgdorferi kloner kan deles inn i to brede kategorier med hensyn til deres evne til å bli manipulert genetisk^13,14. Høy passasje, laboratorietilpassede isolater blir ofte lett transformert, men har vanligvis mistet plasmidene som er essensielle for smittsomhet, oppfører seg på en fysiologisk avvikende måte, og er ikke i stand til å infisere en pattedyrvert eller vedvare i en kryssvektor^12,13. Selv om disse klonene har vært nyttige for å dissekere molekylærbiologien til spiroketen i laboratoriet, er de av liten verdi for å studere spirocheten innenfor den biologiske konteksten av den enzootiske syklusen. Lavpassasje smittsomme isolater oppfører seg derimot på en fysiologisk måte som reflekterer en smittsom tilstand og kan fullføre den smittsomme syklusen, men er vanligvis gjenstridig mot innføringen av heterologt DNA og er derfor vanskelig å manipulere for studie^12,13. Vanskeligheten med å transformere isolater med lav passasje er relatert til minst to forskjellige faktorer: (i) isolater med lav passasje klumper seg ofte tett sammen, spesielt under de høye tetthetsforholdene som kreves for elektroporering, og blokkerer dermed mange celler fra enten full påføring av den elektriske ladningen eller tilgang til DNA i media^13,15; og (ii) B. burgdorferi koder for minst to forskjellige plasmidbårne restriksjonsmodifikasjonssystemer (R-M) som kan gå tapt i høypassasjeisolater^14,16. R-M-systemer har utviklet seg slik at bakterier kan gjenkjenne og eliminere fremmed DNA¹⁷. Faktisk har flere studier i B. burgdorferi vist at transformasjonseffektiviteten øker når kilden til DNA er B. burgdorferi i stedet for Escherichia coli^13,16. Dessverre er anskaffelse av den nødvendige høye konsentrasjonen av DNA for elektroporering fra B. burgdorferi et dyrt og tidkrevende prospekt. En annen potensiell bekymring ved elektroporating og valg av lavpassasjeisolater er at prosessen ser ut til å favorisere transformanter som har mistet det kritiske virulensassosierte plasmidet, lp25^14,18,19; dermed kan selve handlingen med genetisk manipulering av lavpassasje B. burgdorferi-isolater via elektroporering velge for kloner som ikke er egnet for biologisk relevant analyse innenfor den enzootiske syklusen²⁰. Gitt disse problemene, kan et system der heterologt DNA kan elektrotransformeres til høypassasje B. burgdorferi-kloner og deretter overføres til lavpassasje smittsomme isolater ved en annen metode enn elektroporering, være et velkomment tillegg til den voksende samlingen av molekylære verktøy tilgjengelig for bruk i Lyme-sykdommen spirochete.

I tillegg til transformasjon (opptak av nakent DNA), er det to andre mekanismer hvor bakterier regelmessig tar opp heterologt DNA: konjugering, som er utveksling av DNA mellom bakterier i direkte fysisk kontakt med hverandre, og transduksjon, som er utveksling av DNA mediert av en bakteriofag²¹. Faktisk har bakteriofagens evne til å formidle HGT blitt brukt som et eksperimentelt verktøy for å dissekere de molekylære prosessene i en rekke bakterielle systemer^22,23,24. B. burgdorferi er ikke naturlig kompetent for opptak av nakent DNA, og det er lite bevis på at B. burgdorferi koder for apparatet som er nødvendig for å fremme vellykket konjugering. Tidligere rapporter har imidlertid beskrevet identifisering og foreløpig karakterisering av φBB-1, en temperert bakteriofag av B. burgdorferi^25,26,27,28. φBB-1 pakker en familie på 30 kb plasmider funnet i B. burgdorferi²⁵; Medlemmene av denne familien har fått betegnelsen CP32s. I samsvar med en rolle for φBB-1 i å delta i HGT blant B. burgdorferi-stammer, rapporterte Stevenson og medarbeidere en identisk cp32 funnet i to stammer med ellers forskjellige cp32s, noe som tyder på en nylig deling av denne cp32 mellom disse to stammene, sannsynligvis via transduksjon²⁹. Det er også tegn på signifikant rekombinasjon via HGT blant cp32s i et ellers relativt stabilt genom^30,31,32,33. Endelig har evnen til φBB-1 til å transdusere både cp32s og heterolog shuttle vector DNA mellom celler av samme stamme og mellom celler av to forskjellige stammer blitt demonstrert tidligere^27,28. Gitt disse funnene har φBB-1 blitt foreslått som et annet verktøy som skal utvikles for disseksjon av molekylærbiologien til B. burgdorferi.

Målet med denne rapporten er å detaljere en metode for å indusere og rense φBB-1 fra B. burgdorferi, samt gi en protokoll for å utføre en transduksjonsanalyse mellom B. burgdorferi-kloner og velge og screene potensielle transduktanter.

Protocol

Alle eksperimenter ved bruk av rekombinante DNA- og BSL-2-organismer ble gjennomgått og godkjent av Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee. 1. Forberedelse av B. burgdorferi-kultur for produksjon av φBB-1 Forbered Barbour-Stoenner-Kelly medium supplert med 6,6% varmeinaktivert normalt kaninserum (BSK)15. For 1 liter 1x BSK kombineres komponentene oppført i tabell 1 i 900 ml vann, justerer pH til 7,6 ved bruk av <st…

Representative Results

Bruken av bakteriofag for å flytte DNA mellom lettere transformerbare B. burgdorferi-stammer eller kloner som er gjenstridige mot elektrotransformasjon, representerer et annet verktøy for fortsatt molekylær undersøkelse av determinanter for Lyme-sykdommen. Transduksjonsanalysen beskrevet her kan modifiseres etter behov for å lette bevegelsen av DNA mellom kloner av interesse ved bruk av enten ett eller to antibiotika for valg av potensielle transduktanter. Transduksjonen av både profag-DNA og heterologe <e…

Discussion

Bruken av transduksjon kan representere en metode for å overvinne minst noen av de biologiske og tekniske barrierer knyttet til elektrotransformasjonen av B. burgdorferi 1,4,13,37. I mange systemer kan bakteriofag flytte vert (ikke-prophage) DNA mellom bakterieceller ved enten generalisert eller spesialisert transduksjon 22,23,24,49,50.<sup class="xr…

Materials

1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)	Millipore Sigma	S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)	USA Scientific	1450-0810	holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)	USA Scientific	5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)	Millipore Sigma		CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)	USA Scientific	1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE	Dot Scientific inc.	AGLE-500
Bacto Neopeptone	Gibco	DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate	Gibco	255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)	Gemini Bio-Products	700-104P
Chloroform (for molecular biology)	Thermo Fisher Scientific	BP1145-1	CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)	US Biological	C5900-01	cell culture grade
Erythromycin	Research Products International Corp	E57000-25.0
Gentamicin reagent solution	Gibco	15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Kanamycin sulfate	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)	Millipore Sigma	SLGSM33SS	to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine	MP Biomedicals, LLC	100068
Oligonucleotides (primers for PCR)	IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)	G Biosciences	786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber	Hausser scientific	HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass	Hausser scientific	HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	Thermo Fisher Scientific	BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)	Pel-Freez Biologicals	31119-3	heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes	USA Scientific	9750-9150
Sodium bicarbonate	Thermo Fisher Scientific	BP328-500
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	BP358-1
Sodium pyruvate	Millipore Sigma	P8674-25G
Spectronic Genesys 5	Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution	Millipore Sigma	S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate	Millipore Sigma	S1804-500G	sodium citrate for BSK