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Immunologie et infection

Manipulação Genética Mediada por Fagos da Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022
doi:
10.3791/64408
1Department of Biomedical Sciences,Quinnipiac University

Summary

A capacidade dos bacteriófagos de mover o DNA entre as células bacterianas os torna ferramentas eficazes para a manipulação genética de seus hospedeiros bacterianos. Apresenta-se aqui uma metodologia para induzir, recuperar e utilizar φBB-1, um bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transduzir DNA heterólogo entre diferentes cepas da espiroqueta da doença de Lyme.

Abstract

A introdução de DNA estranho na espiroqueta Borrelia burgdorferi foi quase exclusivamente realizada por transformação usando eletroporação. Este processo tem eficiências notavelmente mais baixas na espiroqueta da doença de Lyme em relação a outras bactérias Gram-negativas melhor caracterizadas. A taxa de sucesso da transformação é altamente dependente de ter concentrado quantidades de DNA de alta qualidade de origens específicas e está sujeita a uma variabilidade significativa de cepa para cepa. Meios alternativos para a introdução de DNA estranho (ou seja, vetores de transporte, repórteres fluorescentes e marcadores de resistência a antibióticos) em B. burgdorferi poderiam ser uma adição importante ao arsenal de ferramentas úteis para a manipulação genética da espiroqueta da doença de Lyme. Os bacteriófagos têm sido bem reconhecidos como mecanismos naturais para o movimento do DNA entre bactérias em um processo chamado transdução. Neste estudo, um método foi desenvolvido para usar o onipresente fago borrelial φBB-1 para transduzir DNA entre células de B. burgdorferi de origens genéticas iguais e diferentes. O DNA transduzido inclui DNA borrelial e DNA heterólogo na forma de pequenos vetores de transporte. Esta demonstração sugere um uso potencial de transdução mediada por fagos como complemento à eletroporação para a manipulação genética da espiroqueta da doença de Lyme. Este relato descreve métodos para a indução e purificação do fago φBB-1 de B. burgdorferi, o uso deste fago em ensaios de transdução e a seleção e triagem de potenciais transdutores.

Introduction

O desenvolvimento de ferramentas para a manipulação genética da bactéria espiroqueta Borrelia burgdorferi tem acrescentado um valor imensurável à compreensão da natureza da doença de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tem um genoma extraordinariamente complexo, composto por um pequeno cromossomo linear e plasmídeos lineares e circulares 5,6. A perda espontânea de plasmídeos, o rearranjo intragênico (movimento de genes de um plasmídeo para outro dentro do mesmo organismo) e a transferência horizontal de genes (HGT, o movimento do DNA entre dois organismos) deram origem a uma quantidade estonteante de heterogeneidade genética entre B. burgdorferi (por exemplo, ver Schutzer et al.7). Os genótipos resultantes (ou “cepas”) são todos membros da mesma espécie, mas apresentam diferenças genéticas que influenciam sua capacidade de transmitir e infectar diferentes hospedeiros mamíferos 8,9,10,11. Neste relatório, o termo “estirpe” será utilizado para se referir a B. burgdorferi com um fundo genético derivado naturalmente particular; o termo “clone” será utilizado para se referir a uma estirpe que tenha sido geneticamente modificada para um fim específico ou em resultado de manipulação experimental.

A caixa de ferramentas moleculares disponível para uso em B. burgdorferi inclui marcadores selecionáveis, repórteres de genes, vetores de transporte, mutagênese de transposon, promotores induzíveis e marcadores contra-selecionáveis (para uma revisão, ver Drektrah e Samuels12). O uso efetivo dessas metodologias requer a introdução artificial de DNA heterólogo (estranho) em uma cepa de B. burgdorferi de interesse. Em B. burgdorferi, a introdução do DNA heterólogo é realizada quase que exclusivamente por eletroporação, método que utiliza um pulso de eletricidade para tornar uma membrana bacteriana transitoriamente permeável a pequenos pedaços de DNA introduzidos no meio1. A maioria das células (estimada em ≥99,5%) é morta pelo pulso, mas as células restantes têm alta frequência de retenção do DNA heterólogo13. Embora considerado um dos métodos mais eficientes de introdução de DNA em bactérias, a frequência de eletroporação em B. burgdorferi é muito baixa (variando de 1 transformador em 5 × 104 a 5 × 106 células)13. As barreiras para alcançar frequências mais altas de transformação parecem ser técnicas e biológicas. As barreiras técnicas para o sucesso da eletroporação de B. burgdorferi incluem tanto a quantidade de DNA (>10 μg) que é necessária quanto a exigência de que as espiroquetas estejam exatamente na fase correta de crescimento (meio de bordo, entre 2 × 10 7 células·mL−1 e 7 × 107 células·mL−1) ao preparar células eletrocompetentes 12,13. Essas barreiras técnicas, no entanto, podem ser mais fáceis de superar do que as barreiras biológicas.

Pesquisadores da doença de Lyme reconhecem que os clones de B. burgdorferi podem ser divididos em duas grandes categorias no que diz respeito à sua capacidade de serem manipulados geneticamente13,14. Isolados de alta passagem, adaptados ao laboratório, são frequentemente facilmente transformados, mas geralmente perdem os plasmídeos essenciais para a infectividade, comportam-se de maneira fisiologicamente aberrante e não são capazes de infectar um hospedeiro mamífero ou persistir dentro de um vetor de carrapato12,13. Embora esses clones tenham sido úteis para dissecar a biologia molecular da espiroqueta dentro do laboratório, eles são de pouco valor para estudar a espiroqueta dentro do contexto biológico do ciclo enzoótico. Isolados infecciosos de baixa passagem, por outro lado, comportam-se de maneira fisiológica reflexiva de um estado infeccioso e podem completar o ciclo infeccioso, mas geralmente são recalcitrantes à introdução de DNA heterólogo e, portanto, de difícil manipulação para estudo12,13. A dificuldade em transformar isolados de baixa passagem está relacionada a pelo menos dois fatores diferentes: (i) isolados de baixa passagem muitas vezes se aglutinam firmemente, particularmente sob as condições de alta densidade necessárias para a eletroporação, bloqueando assim muitas células da aplicação completa da carga elétrica ou do acesso ao DNA no meio13,15; e (ii) B. burgdorferi codifica pelo menos dois diferentes sistemas de restrição e modificação (R-M) transmitidos por plasmídeos que podem ser perdidos em isolados de alta passagem14,16. Os sistemas R-M evoluíram para permitir que as bactérias reconheçam e eliminem o DNA estranho17. De fato, vários estudos em B. burgdorferi demonstraram que as eficiências de transformação aumentam quando a fonte do DNA é B. burgdorferi e não Escherichia coli13,16. Infelizmente, adquirir a alta concentração necessária de DNA para eletroporação de B. burgdorferi é uma perspectiva cara e demorada. Outra preocupação potencial ao eletroporar e selecionar isolados de baixa passagem é que o processo parece favorecer transformadores que perderam o plasmídeo crítico associado à virulência, lp2514,18,19; assim, o próprio ato de manipular geneticamente isolados de B. burgdorferi de baixa passagem via eletroporação pode selecionar clones que não são adequados para análise biologicamente relevante dentro do ciclo enzoótico20. Dadas essas questões, um sistema no qual o DNA heterólogo poderia ser eletrotransformado em clones de B. burgdorferi de alta passagem e, em seguida, transferido para isolados infecciosos de baixa passagem por um método diferente da eletroporação poderia ser uma adição bem-vinda à crescente coleção de ferramentas moleculares disponíveis para uso na espiroqueta da doença de Lyme.

Além da transformação (a absorção de DNA nu), existem dois outros mecanismos pelos quais as bactérias absorvem regularmente o DNA heterólogo: a conjugação, que é a troca de DNA entre bactérias em contato físico direto entre si, e a transdução, que é a troca de DNA mediada por um bacteriófago21. De fato, a capacidade do bacteriófago de mediar a HGT tem sido utilizada como ferramenta experimental para dissecar os processos moleculares dentro de vários sistemas bacterianos22,23,24. B. burgdorferi não é naturalmente competente para a absorção de DNA nu, e há pouca evidência de que B. burgdorferi codifica o aparato necessário para promover a conjugação bem-sucedida. Relatos prévios descreveram, no entanto, a identificação e caracterização preliminar do φBB-1, um bacteriófago temperado de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 empacota uma família de plasmídeos de 30 kb encontrados em B. burgdorferi25; os membros desta família foram designados cp32s. Consistente com um papel para φBB-1 na participação em HGT entre cepas de B. burgdorferi, Stevenson et al. relataram uma cp32 idêntica encontrada em duas cepas com cp32s de outra forma díspares, sugerindo um compartilhamento recente dessa cp32 entre essas duas cepas, provavelmente via transdução29. Há também evidências de recombinação significativa via HGT entre os cp32s em um genoma relativamente estável30,31,32,33. Finalmente, a capacidade do φBB-1 de transduzir tanto cp32s quanto DNA vetorial heterólogo entre células da mesma cepa e entre células de duas cepas diferentes foi demonstrada anteriormente27,28. Diante desses achados, o φBB-1 tem sido proposto como outra ferramenta a ser desenvolvida para a dissecação da biologia molecular de B. burgdorferi.

O objetivo deste relato é detalhar um método para induzir e purificar o fago φBB-1 de B. burgdorferi, bem como fornecer um protocolo para a realização de um ensaio de transdução entre clones de B. burgdorferi e seleção e triagem de potenciais transdutores.

Protocol

Todos os experimentos usando DNA recombinante e organismos BSL-2 foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade de Quinnipiac. 1. Preparação da cultura de B. burgdorferi para a produção de φBB-1 Preparar o meio Barbour-Stoenner-Kelly suplementado com soro de coelho normal (BSK) inativado pelo calor a 6,6. Para 1 L de 1x BSK, combinar os componentes listados na Tabela 1 em 900 mL de ág…

Representative Results

O uso de bacteriófagos para mover o DNA entre cepas de B. burgdorferi mais facilmente transformáveis ou clones que são recalcitrantes à eletrotransformação representa outra ferramenta para a investigação molecular contínua dos determinantes da doença de Lyme. O ensaio de transdução aqui descrito pode ser modificado conforme necessário para facilitar o movimento do DNA entre quaisquer clones de interesse usando um ou dois antibióticos para a seleção de transdutores potenciais. A transdução do DN…

Discussion

O uso da transdução poderia representar um método de superação de pelo menos algumas das barreiras biológicas e técnicas associadas à eletrotransformação de B. burgdorferi 1,4,13,37. Em muitos sistemas, o bacteriófago pode mover o DNA do hospedeiro (não prófago) entre células bacterianas por transdução generalizada ou especializada 22,23,24,49,50.</sup…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O autor deseja agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor por sua discussão útil e Vareeon (Pam) Chonweerawong por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Ciências Biomédicas e bolsas de pesquisa do corpo docente para Christian H. Eggers da Escola de Ciências da Saúde da Universidade de Quinnipiac.

Materials

1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK
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Citer Cet Article
Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).
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