Fagmedierad genmanipulation av borrelia Spirokete Borrelia burgdorferi

Summary

Bakteriofagens förmåga att flytta DNA mellan bakterieceller gör dem till effektiva verktyg för genetisk manipulation av deras bakterievärdar. Här presenteras en metod för att inducera, återhämta sig och använda φBB-1, en bakteriofag av Borrelia burgdorferi, för att transducera heterologt DNA mellan olika stammar av borrelia spiroket.

Abstract

Införandet av främmande DNA i spiroketen Borrelia burgdorferi har nästan uteslutande åstadkommits genom transformation med hjälp av elektroporation. Denna process har särskilt lägre effektivitet i borrelia spirokete i förhållande till andra, bättre karakteriserade gramnegativa bakterier. Graden av framgång för transformation är mycket beroende av att ha koncentrerade mängder av högkvalitativt DNA från specifika bakgrunder och är föremål för betydande stam-till-stam-variation. Alternativa medel för att införa främmande DNA (dvs. skyttelvektorer, fluorescerande reportrar och markörer för antibiotikaresistens) i B. burgdorferi kan vara ett viktigt tillskott till beväpningen av användbara verktyg för genetisk manipulation av borrelia spiroket. Bakteriofag har varit välkända som naturliga mekanismer för rörelse av DNA bland bakterier i en process som kallas transduktion. I denna studie har en metod utvecklats för att använda den allestädes närvarande borreliala fagen φBB-1 för att transducera DNA mellan B. burgdorferi-celler med både samma och olika genetiska bakgrunder. Det transducerade DNA:t innefattar både borreliellt DNA och heterologt DNA i form av små skyttelvektorer. Denna demonstration tyder på en potentiell användning av fagmedierad transduktion som ett komplement till elektroporering för genetisk manipulation av borrelia spiroket. Denna rapport beskriver metoder för induktion och rening av φBB-1 från B. burgdorferi, användningen av denna i transduktionsanalyser och urval och screening av potentiella transduktanter.

Introduction

Utvecklingen av verktyg för genmanipulation av spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tillfört ett omätbart värde till förståelsen av borrelians natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har ett ovanligt komplext genom som består av en liten linjär kromosom och både linjära och cirkulära plasmider ^5,6. Spontan plasmidförlust, intragen omläggning (rörelse av gener från en plasmid till en annan inom samma organism) och horisontell genöverföring (HGT, DNA-rörelsen mellan två organismer) har gett upphov till en svindlande mängd genetisk heterogenitet bland B. burgdorferi (för ett exempel, se Schutzer et ^al.7). De resulterande genotyperna (eller “stammarna”) är alla medlemmar av samma art men har genetiska skillnader som påverkar deras förmåga att överföra till och infektera olika däggdjursvärdar 8,9,10,11. I denna rapport kommer termen “stam” att användas för att hänvisa till B. burgdorferi med en särskild naturligt härledd genetisk bakgrund; Termen “klon” kommer att användas för att hänvisa till en stam som har modifierats genetiskt för ett visst ändamål eller som ett resultat av experimentell manipulation.

Den molekylära verktygslådan som är tillgänglig för användning i B. burgdorferi inkluderar valbara markörer, genreportrar, skyttelvektorer, transposonmutagenes, inducerbara promotorer och motvalbara markörer (för en recension, se Drektrah och Samuels¹²). En effektiv användning av dessa metoder kräver ett artificiellt införande av heterologt (främmande) DNA i en B. burgdorferi-stam av intresse. I B. burgdorferi uppnås införandet av heterologt DNA nästan uteslutande via elektroporering, en metod som använder en puls av elektricitet för att göra ett bakteriemembran övergående permeabelt för små bitar av DNA som införs i mediet¹. Majoriteten av cellerna (uppskattas till ≥99,5%) dödas av pulsen, men de återstående cellerna har en hög frekvens för att behålla det heterologa DNA¹³. Även om det anses vara bland de mest effektiva metoderna för att införa DNA i bakterier, är frekvensen av elektroporering i B. burgdorferi mycket låg (allt från 1 transformant i 5 × 10⁴ till 5 × 10⁶ celler)¹³. Hindren för att uppnå högre omvandlingsfrekvenser verkar vara både tekniska och biologiska. Tekniska hinder för framgångsrik elektroporering av B. burgdorferi inkluderar både mängden DNA (>10 μg) som är nödvändig och kravet på att spiroketerna ska vara i exakt rätt tillväxtfas (mitten av log, mellan 2 × 10 7 celler ·ml−1 och 7 × 10⁷ celler·ml⁻¹) vid framställning av elektrokompetenta celler ^12,13. Dessa tekniska hinder kan dock vara lättare att övervinna än de biologiska hindren.

Borreliaforskare inser att B. burgdorferi-kloner kan delas in i två breda kategorier med avseende på deras förmåga att manipuleras genetiskt^13,14. Högpassage, laboratorieanpassade isolat omvandlas ofta lätt men har vanligtvis förlorat de plasmider som är väsentliga för smittsamhet, beter sig på ett fysiologiskt avvikande sätt och kan inte infektera en däggdjursvärd eller kvarstå inom en fästingvektor^12,13. Även om dessa kloner har varit användbara för att dissekera spiroketens molekylärbiologi inom laboratoriet, är de av litet värde för att studera spiroketen inom det biologiska sammanhanget för den enzootiska cykeln. Infektiösa isolat med låg passage, å andra sidan, beter sig på ett fysiologiskt sätt som återspeglar ett infektiöst tillstånd och kan slutföra den infektiösa cykeln men är vanligtvis motsträviga mot införandet av heterologt DNA och är därför svåra att manipulera för studie^12,13. Svårigheten att omvandla lågpassageisolat är relaterad till minst två olika faktorer: (i) lågpassageisolat som ofta tätt klumpar ihop sig, särskilt under de förhållanden med hög densitet som krävs för elektroporering, vilket blockerar många celler från antingen fullständig applicering av den elektriska laddningen eller tillgång till DNA i mediet^13,15; och (ii) B. burgdorferi kodar för minst två olika plasmidburna restriktionsmodifieringssystem (R-M) som kan gå förlorade i högpassageisolat^14,16. R-M-system har utvecklats för att tillåta bakterier att känna igen och eliminera främmande DNA¹⁷. Faktum är att flera studier i B. burgdorferi har visat att omvandlingseffektiviteten ökar när källan till DNA är B. burgdorferi snarare än Escherichia coli^13,16. Tyvärr är det en dyr och tidskrävande möjlighet att förvärva den nödvändiga höga koncentrationen av DNA för elektroporering från B. burgdorferi. Ett annat potentiellt problem vid elektroporering och val av lågpassageisolat är att processen verkar gynna transformanter som har förlorat den kritiska virulensassocierade plasmiden, lp25^14,18,19; således kan själva handlingen att genetiskt manipulera lågpassage B. burgdorferi-isolat via elektroporering välja för kloner som inte är lämpliga för biologiskt relevant analys inom den enzootiska cykeln²⁰. Med tanke på dessa problem kan ett system där heterologt DNA kan elektrotransformeras till B. burgdorferi-kloner med hög passage och sedan överföras till lågpassage-infektiösa isolat med en annan metod än elektroporering vara ett välkommet tillskott till den växande samlingen av molekylära verktyg som är tillgängliga för användning i borreliaspiroketen.

Förutom transformation (upptaget av naket DNA) finns det två andra mekanismer genom vilka bakterier regelbundet tar upp heterologt DNA: konjugering, vilket är utbyte av DNA mellan bakterier i direkt fysisk kontakt med varandra och transduktion, vilket är utbytet av DNA medierat av en bakteriofag²¹. Faktum är att bakteriofagens förmåga att förmedla HGT har använts som ett experimentellt verktyg för att dissekera de molekylära processerna inom ett antal bakteriesystem^22,23,24. B. burgdorferi är inte naturligt kompetent för upptag av naket DNA, och det finns få bevis för att B. burgdorferi kodar för den apparat som är nödvändig för att främja framgångsrik konjugering. Tidigare rapporter har dock beskrivit identifieringen och den preliminära karakteriseringen av φBB-1, en tempererad bakteriofag av B. burgdorferi^25,26,27,28. φBB-1 förpackar en familj av 30 kb plasmider som finns inom B. burgdorferi²⁵; Medlemmarna i denna familj har betecknats CP32S. I överensstämmelse med en roll för φBB-1 i att delta i HGT bland B. burgdorferi-stammar, rapporterade Stevenson et al. en identisk cp32 som hittades i två stammar med annars olika cp32s, vilket tyder på en ny delning av denna cp32 mellan dessa två stammar, troligen via transduktion²⁹. Det finns också tecken på signifikant rekombination via HGT bland cp32:orna i ett annars relativt stabilt genom^30,31,32,33. Slutligen har förmågan hos φBB-1 att transducera både cp32s och heterologt skyttelvektor-DNA mellan celler av samma stam och mellan celler av två olika stammar visats tidigare^27,28. Med tanke på dessa resultat har φBB-1 föreslagits som ett annat verktyg som ska utvecklas för dissektion av molekylärbiologin hos B. burgdorferi.

Målet med denna rapport är att beskriva en metod för att inducera och rena φBB-1 från B. burgdorferi, samt tillhandahålla ett protokoll för att utföra en transduktionsanalys mellan B. burgdorferi-kloner och välja och screena potentiella transduktanter.

Protocol

Alla experiment med rekombinant DNA och BSL-2-organismer granskades och godkändes av Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee. 1. Beredning av B. burgdorferi-kulturen för produktion av φBB-1 Förbered Barbour-Stoenner-Kelly medium kompletterat med 6,6% värmeinaktiverat normalt kaninserum (BSK)15. För 1 liter 1x BSK, kombinera de komponenter som anges i tabell 1 i 900 ml vatten, justera pH-värdet till 7,6 med <stro…

Representative Results

Användningen av bakteriofag för att flytta DNA mellan mer lätt transformerbara B. burgdorferi-stammar eller kloner som är motsträviga mot elektrotransformation representerar ett annat verktyg för fortsatt molekylär undersökning av determinanterna för borrelia. Den transduktionsanalys som beskrivs häri kan modifieras efter behov för att underlätta förflyttningen av DNA mellan alla kloner av intresse med användning av antingen ett eller två antibiotika för val av potentiella transduktanter. Transdu…

Discussion

Användningen av transduktion kan representera en metod för att övervinna åtminstone några av de biologiska och tekniska hinder som är förknippade med elektrotransformationen av B. burgdorferi 1,4,13,37. I många system kan bakteriofag flytta värd-DNA (icke-prophage) mellan bakterieceller genom antingen generaliserad eller specialiserad transduktion 22,23…

Materials

1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)	Millipore Sigma	S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)	USA Scientific	1450-0810	holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)	USA Scientific	5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)	Millipore Sigma		CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)	USA Scientific	1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE	Dot Scientific inc.	AGLE-500
Bacto Neopeptone	Gibco	DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate	Gibco	255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)	Gemini Bio-Products	700-104P
Chloroform (for molecular biology)	Thermo Fisher Scientific	BP1145-1	CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)	US Biological	C5900-01	cell culture grade
Erythromycin	Research Products International Corp	E57000-25.0
Gentamicin reagent solution	Gibco	15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Kanamycin sulfate	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)	Millipore Sigma	SLGSM33SS	to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine	MP Biomedicals, LLC	100068
Oligonucleotides (primers for PCR)	IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)	G Biosciences	786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber	Hausser scientific	HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass	Hausser scientific	HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	Thermo Fisher Scientific	BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)	Pel-Freez Biologicals	31119-3	heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes	USA Scientific	9750-9150
Sodium bicarbonate	Thermo Fisher Scientific	BP328-500
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	BP358-1
Sodium pyruvate	Millipore Sigma	P8674-25G
Spectronic Genesys 5	Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution	Millipore Sigma	S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate	Millipore Sigma	S1804-500G	sodium citrate for BSK