Микродиссекция глаза грызуна
Summary
В данной работе представлен протокол микродиссекции глаза у грызунов. Процесс включает энуклеацию глазного яблока вместе с мигательной мембраной (т.е. третьим веком). Затем следует разделение заднего и переднего наглазников.
Abstract
Глазное микрорассечение глаза грызуна включает сегментацию энуклеированного глазного яблока с прикрепленной мигательной мембраной или третьим веком для получения переднего и заднего наглазников. С помощью этого метода подчасти глаза, включая ткань роговицы, нервную ткань, ткань пигментного эпителия сетчатки (RPE) и хрусталик, могут быть получены для цельных суспензий, криосекций и/или одноклеточных суспензий конкретной ткани глаза. Наличие третьего века представляет собой уникальные и значительные преимущества, поскольку оно способствует поддержанию ориентации глаза, что важно для понимания физиологии глаза после любого локализованного вмешательства или в исследованиях, включающих глазной анализ, связанный с пространственной топографией глаза.
В этом методе мы энуклеировали глазное яблоко в глазнице вместе с третьим веком, осторожно и медленно разрезая экстраокулярные мышцы и разрывая зрительный нерв. Глазное яблоко было проткнуто через лимб роговицы с помощью микролезвия. Разрез был использован в качестве точки входа, что позволило разрезать вдоль роговицы-склерального соединения путем введения микроножниц через точку разреза. Небольшие и непрерывные надрезы по окружности делались до тех пор, пока чашечки не разошлись. Они могут быть дополнительно рассечены путем осторожного отслаивания полупрозрачного слоя нервной сетчатки с помощью щипцов для наложения швов Colibri для получения слоев нервной сетчатки и RPE. Далее от периферии перпендикулярно к зрительному центру делали три/четыре равноудаленных разреза до тех пор, пока не был достигнут зрительный нерв. Это открыло полусферические чашечки в форме цветка, так что они упали плашмя и могли быть легко установлены. Этот метод был использован в нашей лаборатории для целых срезов роговицы и сетчатки. Наличие третьего века очерчивает носово-временную ориентацию, что позволяет изучать различные вмешательства клеточной терапии после трансплантации и, таким образом, целенаправленную физиологическую валидацию, жизненно важную для визуализации и точного представления в таких исследованиях.
Introduction
Вскрытие глаза является важным методом в офтальмологических исследованиях и позволило исследователям получить доступ к сегментам глаза для целевых исследований. Ранее офтальмологи полагались на глазную ткань больных людей для своих исследований. Однако постепенно растущее число штаммов офтальмологических моделей грызунов1 с годами уменьшило потребность в глазной ткани человека. Эти штаммы мышей позволили глубже понять глазные заболевания и вмешательства. Тем не менее, они также породили потребность в инновационных методах микродиссекции глаза. Малый размер и ограниченная область операции серьезно ограничивают эффективный доступ к подразделению глаза. Кроме того, из-за однородной клеточной сборки задних и передних глазных чашек трудно проводить целенаправленные вмешательства после рассечения. Современные методы микродиссекции лазера2 и хирургической микродиссекции 3,4 недостаточны для удовлетворения таких требований глазных исследований. Лазерная микродиссекция очень эффективна при анализе отдельных клеток, но конкретная ткань должна быть микрорассечена перед лазерной процедурой2. Этот метод может изолировать небольшие области, представляющие интерес, из предварительно рассеченной ткани для молекулярного анализа. Таким образом, этот метод не подходит для подготовки цельных креплений или для изоляции окулярных слоев в осевой части для оптимальной визуализации.
Хирургический метод является наиболее широко используемым методом; Этот метод включает в себя иммобилизацию глаза через зрительный нерв5 с последующим вскрытием. Эта практика трудна и может повредить любую хрупкую ткань, так как сферический глаз продолжает двигаться во время рассечения. Несмотря на то, что он полезен для изоляции различных участков слоев сетчатки, этот метод не может разграничить пространственную ориентацию ткани при рассечении.
Во время диссекции сохранение присутствия прикрепленной мигательной мембраны или третьего века (рис. 1) представляет собой уникальные и значительные преимущества. В этом методе сначала глазное яблоко энуклеируется третьим веком. Затем третье веко используется для иммобилизации глаза6 (рис. 2А). Затем следует прокалывание глазного яблока через лимб роговицы и использование разреза в качестве точки входа (рис. 2B, C). Затем наглазники разделяют, разрезая по окружности спереди и сзади (рис. 2D-G). Рассекая заднюю чашку глаза, можно идентифицировать полупрозрачный слой нервной сетчатки и аккуратно отслаивать. Затем в полученных полусферических передних и задних чашечках делаются три или четыре равноудаленных разреза, которые позволяют этим чашечкам в форме цветка падать плашмя на предметное стекло (рис. 2H).
Третье веко способствует простому и эффективному обращению во время рассечения, тем самым обеспечивая минимальное повреждение тканей при доступе к различным глазным слоям и при производстве цельных креплений. Кроме того, наличие третьего века помогает обнаружить и изучить локализованные вмешательства во время визуализации.
Процедура в нашей лаборатории была выполнена на штамме мыши CBA / J или rd1 на P28 любого пола. Процедура может быть выполнена на любом штамме, возрасте или поле животного и не имеет смещения в соответствии с этими характеристиками.
Животные были закуплены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и содержались в Центре мелких животных (SAF) в Национальном институте иммунологии (NII). Они содержались в индивидуальных вентилируемых клетках (IVC) и получали свободный доступ к подкисленной автоклавной воде и пище. Они поддерживались при температуре 21-23 °C и с циклом светлый/темный 14 ч / 10 ч.
Ниже приведен модифицированный хирургический метод микрорассечения мышиного глаза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Было обнаружено, что микродиссекция глаза глаза является сложной задачей из-за небольшого размера и сферической формы глаза грызуна, а глаз грызуна требует инновационных методов для эффективного обращения8.
В демонстрируемом способе энуклеированное глазн…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Доктор Алакнанда Мишра, кафедра клеточной биологии и анатомии человека, Калифорнийский университет в Дэвисе, США, обучила нас этому методу в Национальном институте иммунологии в Нью-Дели. Эта работа была поддержана основным грантом, полученным от Департамента биотехнологии правительства Индии Национальному институту иммунологии в Нью-Дели. P.S. получил научную стипендию от Департамента биотехнологии.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J inbred mice | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma ; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet) | Reckitt Benckiser , India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma ; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD ; US | REF 303060 | |
| Isoflurane ( Forane) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian ; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty ; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (136), e57576 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563 (2011).
- Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
- Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
- Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163 (2012).
- Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412 (2020).
