Billeddannelse af den aldrende cochlea med lysarkfluorescensmikroskopi
Summary
Et lysarkmikroskop blev udviklet til at afbilde og digitalisere hele cochlea.
Abstract
Døvhed er den mest almindelige sensoriske svækkelse, der påvirker ca. 5% eller 430 millioner mennesker verden over ifølge Verdenssundhedsorganisationen1. Aldring eller presbycusis er en primær årsag til sensorineuralt høretab og er karakteriseret ved skader på hårceller, spiralganglionneuroner (SGN’er) og stria vascularis. Disse strukturer befinder sig i cochlea, som har en kompleks, spiralformet anatomi af membranøst væv suspenderet i væske og omgivet af knogler. Disse egenskaber gør det teknisk vanskeligt at undersøge og kvantificere histopatologiske ændringer. For at imødekomme dette behov udviklede vi et lysarkmikroskop (TSLIM), der kan afbilde og digitalisere hele cochlea for at lette studiet af struktur-funktionsforhold i det indre øre. Veljusterede serielle sektioner af hele cochlea resulterer i en stak billeder til tredimensionel (3D) volumengengivelse og segmentering af individuelle strukturer til 3D-visualisering og kvantitativ analyse (dvs. længde, bredde, overflade, volumen og tal). Cochleae kræver minimale behandlingstrin (fiksering, afkalkning, dehydrering, farvning og optisk clearing), som alle er kompatible med efterfølgende billeddannelse i høj opløsning ved scanning og transmissionselektronmikroskopi. Da alle væv er til stede i stakkene, kan hver struktur vurderes individuelt eller i forhold til andre strukturer. Da billeddannelse desuden bruger fluorescerende sonder, kan immunhistokemi og ligandbinding bruges til at identificere specifikke strukturer og deres 3D-volumen eller fordeling inden for cochlea. Her brugte vi TSLIM til at undersøge cochleae fra ældre mus for at kvantificere tabet af hårceller og spiralganglionneuroner. Derudover blev avancerede analyser (f.eks. Klyngeanalyse) brugt til at visualisere lokale reduktioner af spiralganglionneuroner i Rosenthals kanal langs dens 3D-volumen. Disse tilgange demonstrerer TSLIM-mikroskopiens evne til at kvantificere struktur-funktionsforhold inden for og mellem cochleae.
Introduction
Cochlea er det perifere sensoriske organ til hørelse hos pattedyr. Det har en kompleks spiralanatomi af gentagne sensoriske og understøttende celler, der er anatomisk specialiserede til at detektere lydvibrationer og overføre dem til hjernen for opfattelsen af hørelse. De vigtigste sensoriske elementer er de indre og ydre hårceller og deres inderverende nervefibre, hvis cellekroppe udgør spiralganglionen, som ligger inden for Rosenthals kanal (figur 1). Disse sensoriske og neurale strukturer er tonotopisk arrangeret således, at højfrekvente lyde transduceres i cochlear basen og lavfrekvente lyde transduceres i cochlea apex2. Et anatomisk kort over denne sensoriske cellefordeling langs spirallængden af den understøttende basilarmembran kaldes et cytocochleogram3 og kan sammenlignes med høretab som funktion af frekvens som afbildet i et audiogram.
Cochleas membranlabyrint, som er omgivet af tætte knogler, gør det teknisk vanskeligt at undersøge mere end én cochlear struktur ad gangen. Derfor er begrundelsen for at udvikle et lysarkmikroskop at producere veljusterede serielle sektioner af den komplette cochlea, så alle cochlearstrukturer kan undersøges i forhold til hinanden i 3D-rekonstruktioner. Voie et al.4 og Voie og Spelman5 designede det første lysarkmikroskop, kaldet ortogonalt plan fluorescens optisk sektionering (OPFOS) mikroskop, til optisk at sektionere hele cochlea. Dette mikroskop blev imidlertid aldrig kommercielt udviklet; så vores mål var at konstruere et lysarkmikroskop kaldet et tyndt ark laserbilleddannelsesmikroskop (TSLIM; Figur 2). Design- og konstruktionsdetaljerne for TSLIM er tidligere blevet offentliggjort8. TSLIM foretog flere forbedringer i forhold til OPFOS, herunder brug af et digitalt kamera i svagt lys versus et CCD-kamera til billedindsamling, optisk kodede mikropositionere til nøjagtig og reproducerbar bevægelse af prøven gennem lysarket, brug af et kommercielt tilgængeligt, optisk klart prøvekammer og Rhodaminfarvning i ethanol snarere end i clearingopløsningen for at forhindre pletudfældning i vævet. Kommerciel udvikling af lysarkmikroskoper som SPIM6 har fokuseret på højopløsningsbilleddannelse af levende, små gennemsigtige prøver, men er uegnede til hele cochlear-billeddannelse, da de mangler tilstrækkelig arbejdsafstand. En gennemgang af udviklingen af andre lysarkmikroskoper blev offentliggjort af Santi7. TSLIMs primære fordel i forhold til andre histologiske metoder til undersøgelse af cochlea er optisk at sektionere væv til 3D-rekonstruktion, samtidig med at prøvens integritet bevares, så den kan bruges ved andre histologiske metoder. En anden fordel ved TSLIM-billeddannelse er, at kun et tyndt lysark produceret af en laser udsættes for vævet sammenlignet med eksponering for hele vævstykkelsen for laseren som ved konfokal mikroskopi. Vævsrydning for at minimere lysspredning og det faktum, at kun en lille del af vævet udsættes for laseren, resulterer i minimal fluorkromfading (fotoblegning) med lyspladelaserbilleddannelse. Imidlertid ændrer processen med fiksering, dehydrering og rydning morfologien af cochlear strukturer og resulterer i vævskrympning sammenlignet med levende væv. Den faktiske mængde vævskrympning, der opstår, blev ikke bestemt.
TSLIM blev udviklet af Shane Johnson og otte tyske optiske ingeniørstuderende (se anerkendelser). TSLIM konstruktionsdetaljer blev leveret af Santi et al.8 og en scanningsversion (sTSLIM) af Schröter et al.9. TSLIM fungerer som et ikke-destruktivt mikrotomt til optisk sektionsprøver og som et mikroskop til at indsamle 2D-serielle sektioner gennem cochleas fulde bredde og tykkelse. TSLIM kan afbilde både små (mm) og store (cm), tykke prøver. Linser er luftmonteret for at give mulighed for lange arbejdsafstande med opsamlingsmål på 1x og 2x på et dissektionsmikroskop. Dissektionsmikroskopet har også zoomoptik, der gør det muligt for TSLIM at løse subcellulære og synaptiske strukturer på celler. TSLIM er udstyret med både en blå (473 nm) og grøn (532 nm) laser til belysning, der gør det muligt at bruge en række fluorescerende sonder til billeddannelse. Målet med TSLIM er at producere veljusterede optiske 2D-sektioner gennem en hel cochlea for en komplet digital rekonstruktion af cochlear væv. Da det er en fluorescerende metode, kan ligander og immunhistokemi også bruges til at identificere specifikke cochleære strukturer.
Oprindeligt blev en cylindrisk linse brugt til at producere to modsatte gaussiske lysark, men det producerede absorptionsbilleddannelsesartefakter. På grund af Keller et al.10’s arbejde blev den faste cylindriske linse erstattet af et scanningsgalvanometerspejl for at producere lysarket9. Da midten af lysarket desuden er tyndest ved stråletaljen, produceres sTSLIM 2D-billeder ved at indsamle en sammensætning af X-aksekolonner med data over prøvens bredde (figur 3). Denne metode blev først beskrevet af Buytaert og Dircks11. TSLIM brugerdefineret software til at drive og indsamle billeder blev udviklet ved hjælp af et grafisk program til instrumentstyring. Lysarket bevæger sig gennem prøven og belyser et fluorescerende plan i vævet. Dette fluorescerende plan projiceres ortogonalt gennem den gennemsigtige prøve og opsamles af et dissektionsmikroskop. Optisk kodede mikropositionere tillader scanning gennem stråletaljen i X-aksen for at indsamle et enkelt sammensat 2D-billede, og derefter flytter Z-aksemikropositionen prøven til et dybere plan i vævet for at opnå en stak seriale, snittede 2D-billeder (Video 1, figur 4). Der indsamles en stak translationelle billeder gennem hele bredden, tykkelsen og længden af cochlea, og syning af billeder er ikke påkrævet (video 2). Billedstakken overføres til en anden computer og indlæses i et 3D-gengivelsesprogram til 3D-rekonstruktion og kvantificering. Billedstablerne indeholder alle de digitale oplysninger om en cochleas morfologi ved mikroskopets opløsning. Men hvis der kræves en højere opløsning, kan den intakte cochlea behandles yderligere ved destruktive histologiske metoder såsom mikrotomsektionering, scanning og transmissionselektronmikroskopi.
3D-gengivelsesprogrammet bruges til at segmentere forskellige cochlear-strukturer til 3D-gengivelse og kvantitativ analyse. Til segmentering spores hver struktur i hvert 2D-billede af stakken ved hjælp af en anden farve af en grafiktablet og pen (figur 5). Til dato er 20 forskellige cochlear strukturer blevet segmenteret (figur 6). Efter segmentering kan der udføres en række 3D-analyser. For eksempel kan 3D-gengivelsessoftware praktisk talt resektionere cochlea i ethvert plan langs strukturens centroid. Video 3 viser sektionering, der tangerer Corti-organet, som afslører hårcellerne langs basilarmembranens længde. Denne proces kræver først manuel segmentering af strukturen af interesse. Dernæst beregnes strukturens centroid baseret på de mindste kvadraters pasform af splinepunkter placeret langs midten af strukturen fra dens base til dens top, hvilket muliggør en tilnærmelse af strukturens længde (Video 4). En lignende proces kaldet skeletonisering kan bruges til at visualisere strukturens radiale bredde langs dens længde ved hjælp af et farvekort (Video 4). Det samlede volumen af hver struktur beregnes af programmet efter segmentering, men relative afstande kan også kvantificeres og visualiseres med farvekort i en 3D-gengivelsessoftware (figur 7). Segmenterede strukturer kan også eksporteres for at producere forstørrede, solid-plast modelgengivelser (figur 8). Derudover kan halvautomatisk celletælling også udføres ved hjælp af 3D-gengivelsessoftware (figur 9). Immunhistokemi og ligandbinding kan bruges til at plette specifikke cochleære strukturer, og disse strukturer kan isoleres fra andre cochleære strukturer til morfometrisk vurdering, såsom fremstilling af et cytocochleogram (figur 10). Længde, bredde, overflade, volumen og antal af alle cochlear strukturer kan bestemmes ud fra 3D-modellerne, hvilket gør denne tilgang ideel til kortlægning af cochlear skader på funktionsnedsættelser. Specifikt kan cochlearskader på grund af aldring, støjinduceret traume eller andre fornærmelser vises og kvantificeres i 3D-cochlea-rekonstruktioner fra optiske 2D-sektioner. Når en cochlea er blevet digitaliseret, er der adskillige billeddannelsesalgoritmer, der kan bruges til at vurdere cochlear skader på ethvert væv i cochlea i det anatomiske register til andre cochlear væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optisk sektionering ved lysarkmikroskopi til undersøgelse af cochlear strukturer er ikke mekanisk destruktiv som andre mere traditionelle histologiske metoder, og det giver et komplet digitalt overblik over cochlear strukturer i forhold til hinanden. Tidligere metoder såsom overfladepræparater af Corti14-organet gav et kort over hårtab langs basilarmembranens længde, men SGN-tab kunne ikke vurderes, da vævet var blevet dissekeret væk for at afsløre Corti-organet. Alternativt giver midt-mod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er blevet støttet af tilskud fra National Institute on Deafness and Other Communication Disorders fra National Institutes of Health, Kellogg Foundation og private donationer fra Bridget Sperl og John McCormick. TSLIM er udviklet med fremragende hjælp fra Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg og Julian Wuester fra Technical University of Illmenau, Tyskland, tilsyn af deres mentorer (Stefan Sinzinger og Rene Theska) og James Leger.
Materials
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021)
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. The digital cytocochleogram. Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. . On making human and animal preparations transparent. , (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
