Imagerie de la cochlée vieillissante avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière

Summary

Un microscope à feuille de lumière a été développé pour imager et numériser la cochlée entière.

Abstract

La surdité est la déficience sensorielle la plus courante, affectant environ 5% ou 430 millions de personnes dans le monde selon l’Organisation mondiale de la santé¹. Le vieillissement ou la presbyacousie est une cause primaire de perte auditive neurosensorielle et se caractérise par des dommages aux cellules ciliées, aux neurones ganglionnaires en spirale (SGN) et à la strie vasculaire. Ces structures résident dans la cochlée, qui a une anatomie complexe en forme de spirale de tissus membraneux suspendus dans un liquide et entourés d’os. Ces propriétés rendent techniquement difficile l’étude et la quantification des changements histopathologiques. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un microscope à feuille de lumière (TSLIM) qui peut imager et numériser l’ensemble de la cochlée pour faciliter l’étude des relations structure-fonction dans l’oreille interne. Des sections en série bien alignées de l’ensemble de la cochlée donnent une pile d’images pour le rendu de volume tridimensionnel (3D) et la segmentation de structures individuelles pour la visualisation 3D et l’analyse quantitative (c’est-à-dire la longueur, la largeur, la surface, le volume et le nombre). Les cochlées nécessitent des étapes de traitement minimales (fixation, décalcification, déshydratation, coloration et effacement optique), qui sont toutes compatibles avec l’imagerie à haute résolution ultérieure par microscopie électronique à balayage et à transmission. Étant donné que tous les tissus sont présents dans les piles, chaque structure peut être évaluée individuellement ou par rapport à d’autres structures. De plus, comme l’imagerie utilise des sondes fluorescentes, l’immunohistochimie et la liaison aux ligands peuvent être utilisées pour identifier des structures spécifiques et leur volume 3D ou leur distribution dans la cochlée. Ici, nous avons utilisé TSLIM pour examiner les cochlées de souris âgées afin de quantifier la perte de cellules ciliées et de neurones ganglionnaires en spirale. De plus, des analyses avancées (par exemple, l’analyse en grappes) ont été utilisées pour visualiser les réductions locales des neurones ganglionnaires en spirale dans le canal de Rosenthal le long de son volume 3D. Ces approches démontrent la capacité de la microscopie TSLIM à quantifier les relations structure-fonction au sein et entre les cochlées.

Introduction

La cochlée est l’organe sensoriel périphérique pour l’audition chez les mammifères. Il a une anatomie en spirale complexe de cellules sensorielles et de soutien répétitives qui sont anatomiquement spécialisées pour détecter les vibrations sonores et les transmettre au cerveau pour la perception de l’audition. Les principaux éléments sensoriels sont les cellules ciliées internes et externes et leurs fibres nerveuses innervantes dont les corps cellulaires composent le ganglion en spirale, qui réside dans le canal de Rosenthal (Figure 1). Ces structures sensorielles et neuronales sont disposées de manière tonotopique de telle sorte que les s....

Protocol

Toutes les procédures et l’utilisation d’animaux vivants ont été examinées et approuvées (Protocol ID #2010-38573A) par le Comité de soin et d’utilisation des établissements de l’Université du Minnesota (IACUC) et les enquêteurs qui utilisent ces animaux ont été soigneusement formés et testés par les vétérinaires des ressources animales de recherche (RAR) avant d’avoir accès aux installations animalières. Des souris mâles et femelles ont été utilisées dans cette étude.

1. Enlèvement de la cochlée pour la fixation et traitement des tissus pour l’imagerie

1. Euthanasier une souris par inhalation de CO₂ . Déc....

Results

Puisque le thème de ce numéro spécial est l’imagerie des effets du vieillissement chez la cochlée, une jeune cochlée (HS2479, souche CBA) et âgée (23 mois, souris souche HS2521, C57) sera utilisée comme exemples. Il convient de noter que TSLIM est capable d’imager une variété de spécimens, y compris des cochlées d’humains, de mammifères, d’autres rongeurs et de poissons, ainsi que d’autres organes tels que le cerveau.

Johnson et al. ¹³ ont publié un article sur les SGN .......

Discussion

La coupe optique par microscopie à feuille de lumière pour l’examen des structures cochléaires n’est pas mécaniquement destructrice comme d’autres méthodes histologiques plus traditionnelles, et elle fournit une vue numérique complète des structures cochléaires les unes par rapport aux autres. Des méthodes antérieures telles que les préparations de surface de l’organe de Corti¹⁴ ont fourni une carte de la perte de cellules ciliées le long de la membrane basilaire, mais la perte de SGN n’a pas pu ê.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Logiciel de rendu 3D Amira ThermoFisher	Scientific		Adresse : 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzoate de benzyle (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.  ;		Adresse : PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic  ;	Bondic  ;		Adresse : 235 Industrial Parkway S., unité 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95 % et 100 %  ;	Université du Minnesota		Adresse : General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA)  ; (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.  ;		Adresse : PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Programme graphique LabVIEW et Vision	National Instruments		Adresse : 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
salicylate de méthyle (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.  ;		Adresse : PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Microscope de dissection Olympus MVX10	Olympus Corp		Adresse : 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)  ;	Sigma-Aldrich, Inc.  ;		Adresse : PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Cellule de fluomètre Starna (3-G-20)	Cellules		Adresse : PO Box 1919, Atascadero, CA 82423