Imagerie de la cochlée vieillissante avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière

Summary

Un microscope à feuille de lumière a été développé pour imager et numériser la cochlée entière.

Abstract

La surdité est la déficience sensorielle la plus courante, affectant environ 5% ou 430 millions de personnes dans le monde selon l’Organisation mondiale de la santé¹. Le vieillissement ou la presbyacousie est une cause primaire de perte auditive neurosensorielle et se caractérise par des dommages aux cellules ciliées, aux neurones ganglionnaires en spirale (SGN) et à la strie vasculaire. Ces structures résident dans la cochlée, qui a une anatomie complexe en forme de spirale de tissus membraneux suspendus dans un liquide et entourés d’os. Ces propriétés rendent techniquement difficile l’étude et la quantification des changements histopathologiques. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un microscope à feuille de lumière (TSLIM) qui peut imager et numériser l’ensemble de la cochlée pour faciliter l’étude des relations structure-fonction dans l’oreille interne. Des sections en série bien alignées de l’ensemble de la cochlée donnent une pile d’images pour le rendu de volume tridimensionnel (3D) et la segmentation de structures individuelles pour la visualisation 3D et l’analyse quantitative (c’est-à-dire la longueur, la largeur, la surface, le volume et le nombre). Les cochlées nécessitent des étapes de traitement minimales (fixation, décalcification, déshydratation, coloration et effacement optique), qui sont toutes compatibles avec l’imagerie à haute résolution ultérieure par microscopie électronique à balayage et à transmission. Étant donné que tous les tissus sont présents dans les piles, chaque structure peut être évaluée individuellement ou par rapport à d’autres structures. De plus, comme l’imagerie utilise des sondes fluorescentes, l’immunohistochimie et la liaison aux ligands peuvent être utilisées pour identifier des structures spécifiques et leur volume 3D ou leur distribution dans la cochlée. Ici, nous avons utilisé TSLIM pour examiner les cochlées de souris âgées afin de quantifier la perte de cellules ciliées et de neurones ganglionnaires en spirale. De plus, des analyses avancées (par exemple, l’analyse en grappes) ont été utilisées pour visualiser les réductions locales des neurones ganglionnaires en spirale dans le canal de Rosenthal le long de son volume 3D. Ces approches démontrent la capacité de la microscopie TSLIM à quantifier les relations structure-fonction au sein et entre les cochlées.

Introduction

La cochlée est l’organe sensoriel périphérique pour l’audition chez les mammifères. Il a une anatomie en spirale complexe de cellules sensorielles et de soutien répétitives qui sont anatomiquement spécialisées pour détecter les vibrations sonores et les transmettre au cerveau pour la perception de l’audition. Les principaux éléments sensoriels sont les cellules ciliées internes et externes et leurs fibres nerveuses innervantes dont les corps cellulaires composent le ganglion en spirale, qui réside dans le canal de Rosenthal (Figure 1). Ces structures sensorielles et neuronales sont disposées de manière tonotopique de telle sorte que les sons à haute fréquence sont transduits dans la base cochléaire et les sons à basse fréquence dans l’apex² de la cochlée. Une carte anatomique de cette distribution cellulaire sensorielle le long de la longueur en spirale de la membrane basilaire de soutien est appelée cytocochléogramme³ et peut être comparée à la perte auditive en fonction de la fréquence représentée dans un audiogramme.

Le labyrinthe membraneux de la cochlée, qui est entouré d’os dense, rend techniquement difficile l’examen de plus d’une structure cochléaire à la fois. Par conséquent, la raison d’être du développement d’un microscope à feuille de lumière est de produire des sections en série bien alignées de la cochlée complète afin que toutes les structures cochléaires puissent être examinées les unes par rapport aux autres dans des reconstructions 3D. Voie et ^al.4 et Voie et Spelman⁵ ont conçu le premier microscope à feuille de lumière, appelé microscope à section optique à fluorescence plane orthogonale (OPFOS), pour sectionner optiquement toute la cochlée. Cependant, ce microscope n’a jamais été développé commercialement; notre objectif était donc de construire un microscope à feuille de lumière appelé microscope d’imagerie laser à feuille mince (TSLIM; Graphique 2). Les détails de conception et de construction de TSLIM ont déjà été publiés⁸. TSLIM a apporté plusieurs améliorations par rapport à l’OPFOS, notamment l’utilisation d’un appareil photo numérique à faible luminosité par rapport à une caméra CCD pour la collecte d’images, des micropositionneurs codés optiquement pour un mouvement précis et reproductible de l’échantillon à travers la feuille de lumière, l’utilisation d’une chambre d’échantillon optiquement claire disponible dans le commerce et la coloration à la rhodamine dans l’éthanol plutôt que dans la solution de nettoyage pour empêcher la précipitation des taches dans le tissu. Le développement commercial de microscopes à feuille de lumière tels que SPIM⁶ s’est concentré sur l’imagerie à haute résolution de petits échantillons transparents vivants, mais ne convient pas à l’imagerie cochléaire entière car ils manquent de distance de travail adéquate. Une revue du développement d’autres microscopes à feuille de lumière a été publiée par Santi⁷. Le principal avantage de TSLIM par rapport aux autres méthodes histologiques pour examiner la cochlée est de sectionner optiquement les tissus pour la reconstruction 3D tout en préservant l’intégrité du spécimen afin qu’il puisse être utilisé par d’autres méthodes histologiques. Un autre avantage de l’imagerie TSLIM est que seule une mince feuille de lumière produite par un laser est exposée au tissu, par rapport à l’exposition de l’épaisseur du tissu entier au laser comme en microscopie confocale. L’élimination des tissus pour minimiser la diffusion de la lumière et le fait que seule une petite partie du tissu est exposée au laser entraînent une décoloration minimale du fluorochrome (photoblanchiment) avec l’imagerie laser à feuille de lumière. Cependant, le processus de fixation, de déshydratation et de nettoyage modifie la morphologie des structures cochléaires et entraîne un rétrécissement des tissus par rapport aux tissus vivants. La quantité réelle de rétrécissement tissulaire qui se produit n’a pas été déterminée.

TSLIM a été développé par Shane Johnson et huit étudiants allemands en génie optique (voir Remerciements). Les détails de construction de TSLIM ont été fournis par Santi et ^al.8 et une version de numérisation (sTSLIM) par Schröter et ^al.9. TSLIM fonctionne comme un microtome non destructif pour sectionner optiquement des échantillons et comme un microscope pour collecter des coupes en série 2D sur toute la largeur et l’épaisseur de la cochlée. TSLIM peut imager à la fois des spécimens petits (mm) et grands (cm) et épais. Les lentilles sont montées à air pour permettre de longues distances de travail avec des objectifs de collecte de 1x et 2x sur un microscope à dissection. Le microscope à dissection dispose également d’une optique de zoom qui permet à TSLIM de résoudre les structures subcellulaires et synaptiques sur les cellules. TSLIM est équipé d’un laser bleu (473 nm) et vert (532 nm) pour l’éclairage qui permet d’utiliser une variété de sondes fluorescentes pour l’imagerie. L’objectif de TSLIM est de produire des coupes optiques 2D bien alignées à travers une cochlée entière pour une reconstruction numérique complète des tissus cochléaires. Comme il s’agit d’une méthode fluorescente, les ligands et l’immunohistochimie peuvent également être utilisés pour identifier des structures cochléaires spécifiques.

Initialement, une lentille cylindrique a été utilisée pour produire deux feuilles de lumière gaussiennes opposées, mais elle a produit des artefacts d’imagerie par absorption. Grâce aux travaux de Keller et ^al.10, la lentille cylindrique fixe a été remplacée par un miroir galvanomètre à balayage pour produire la feuille de lumière⁹. De plus, comme le centre de la feuille lumineuse est le plus mince à la taille du faisceau, les images 2D sTSLIM sont produites en collectant un composite de colonnes de données sur l’axe X sur toute la largeur de l’échantillon (Figure 3). Cette méthode a été décrite pour la première fois par Buytaert et Dircks¹¹. Le logiciel personnalisé TSLIM pour piloter et collecter des images a été développé à l’aide d’un programme graphique pour le contrôle des instruments. La feuille de lumière traverse l’échantillon et illumine un plan fluorescent à l’intérieur du tissu. Ce plan fluorescent est projeté orthogonalement à travers l’échantillon transparent et est recueilli par un microscope à dissection. Les micropositionneurs codés optiquement permettent de balayer à travers la taille du faisceau dans l’axe X pour collecter une seule image 2D composite et, par la suite, le micropositionneur de l’axe Z déplace l’échantillon vers un plan plus profond dans le tissu pour obtenir une pile d’images 2D en série sectionnées (vidéo 1, figure 4). Une pile d’images translationnelles est collectée sur toute la largeur, l’épaisseur et la longueur de la cochlée, et l’assemblage des images n’est pas nécessaire (vidéo 2). La pile d’images est transférée sur un autre ordinateur et chargée dans un programme de rendu 3D pour la reconstruction et la quantification 3D. Les piles d’images contiennent toutes les informations numériques sur la morphologie d’une cochlée à la résolution du microscope. Cependant, si une résolution plus élevée est requise, la cochlée intacte peut être traitée par des méthodes histologiques destructrices telles que la section microtome, le balayage et la microscopie électronique à transmission.

Le programme de rendu 3D est utilisé pour segmenter différentes structures cochléaires pour le rendu 3D et l’analyse quantitative. Pour la segmentation, chaque structure de chaque image 2D de la pile est tracée à l’aide d’une couleur différente à l’aide d’une tablette graphique et d’un stylet (Figure 5). À ce jour, 20 structures cochléaires différentes ont été segmentées (Figure 6). Après segmentation, diverses analyses 3D peuvent être effectuées. Par exemple, un logiciel de rendu 3D peut pratiquement résectionner la cochlée dans n’importe quel plan le long du centroïde de la structure. La vidéo 3 montre une section tangentielle à l’organe de Corti, qui révèle les cellules ciliées le long de la membrane basilaire. Ce processus nécessite d’abord une segmentation manuelle de la structure d’intérêt. Ensuite, le centroïde de la structure est calculé sur la base de l’ajustement des moindres carrés des points spline placés le long du centre de la structure de sa base à son sommet, permettant ainsi une approximation de la longueur de la structure (vidéo 4). Un processus similaire appelé squelettisation peut être utilisé pour visualiser la largeur radiale de la structure sur toute sa longueur à l’aide d’une carte de couleurs (vidéo 4). Le volume total de chaque structure est calculé par le programme après segmentation, mais les distances relatives peuvent également être quantifiées et visualisées avec des cartes de couleurs dans un logiciel de rendu 3D (Figure 7). Les structures segmentées peuvent également être exportées pour produire des rendus de modèles en plastique solide agrandis (Figure 8). En outre, le comptage semi-automatisé des cellules peut également être effectué à l’aide d’un logiciel de rendu 3D (Figure 9). L’immunohistochimie et la liaison aux ligands peuvent être utilisées pour colorer des structures cochléaires spécifiques et ces structures peuvent être isolées d’autres structures cochléaires pour une évaluation morphométrique telle que la production d’un cytocochléogramme (Figure 10). La longueur, la largeur, la surface, le volume et le nombre de toutes les structures cochléaires peuvent être déterminés à partir des modèles 3D, ce qui rend cette approche idéale pour cartographier les dommages cochléaires aux déficiences fonctionnelles. Plus précisément, les dommages cochléaires dus au vieillissement, aux traumatismes induits par le bruit ou à d’autres insultes peuvent être montrés et quantifiés dans des reconstructions cochléaires 3D à partir de coupes optiques 2D. Une fois qu’une cochlée a été numérisée, il existe de nombreux algorithmes d’imagerie qui peuvent être utilisés pour évaluer les dommages cochléaires de tout tissu de la cochlée dans le registre anatomique à d’autres tissus cochléaires.

Protocol

Toutes les procédures et l’utilisation d’animaux vivants ont été examinées et approuvées (Protocol ID #2010-38573A) par le Comité de soin et d’utilisation des établissements de l’Université du Minnesota (IACUC) et les enquêteurs qui utilisent ces animaux ont été soigneusement formés et testés par les vétérinaires des ressources animales de recherche (RAR) avant d’avoir accès aux installations animalières. Des souris mâles et femelles ont été utilisées dans cette étude. <p class="jove_t…

Representative Results

Puisque le thème de ce numéro spécial est l’imagerie des effets du vieillissement chez la cochlée, une jeune cochlée (HS2479, souche CBA) et âgée (23 mois, souris souche HS2521, C57) sera utilisée comme exemples. Il convient de noter que TSLIM est capable d’imager une variété de spécimens, y compris des cochlées d’humains, de mammifères, d’autres rongeurs et de poissons, ainsi que d’autres organes tels que le cerveau. Johnson et al. 13 ont publié…

Discussion

La coupe optique par microscopie à feuille de lumière pour l’examen des structures cochléaires n’est pas mécaniquement destructrice comme d’autres méthodes histologiques plus traditionnelles, et elle fournit une vue numérique complète des structures cochléaires les unes par rapport aux autres. Des méthodes antérieures telles que les préparations de surface de l’organe de Corti¹⁴ ont fourni une carte de la perte de cellules ciliées le long de la membrane basilaire, mais la perte…

Materials

Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423