लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ एजिंग कोचलेआ की इमेजिंग
Summary
पूरे कोक्लेया की छवि और डिजिटलीकरण के लिए एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप विकसित किया गया था।
Abstract
बहरापन सबसे आम संवेदी हानि है, जो विश्व स्वास्थ्य संगठन 1 के अनुसार दुनिया भर में लगभग 5% या 430 मिलियन लोगों को प्रभावित करताहै। एजिंग या प्रेस्बिकसोसिस सेंसरिन्यूरल श्रवण हानि का एक प्राथमिक कारण है और बालों की कोशिकाओं, सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स (एसजीएन), और स्ट्रिया संवहनी को नुकसान की विशेषता है। ये संरचनाएं कोक्लेया के भीतर रहती हैं, जिसमें द्रव में निलंबित और हड्डी से घिरे झिल्लीदार ऊतकों की एक जटिल, सर्पिल आकार की शारीरिक रचना होती है। ये गुण हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों की जांच और मात्रा निर्धारित करना तकनीकी रूप से मुश्किल बनाते हैं। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए, हमने एक लाइट-शीट माइक्रोस्कोप (टीएसएलआईएम) विकसित किया है जो आंतरिक कान में संरचना-कार्य संबंधों के अध्ययन की सुविधा के लिए पूरे कोक्लेया को छवि और डिजिटल कर सकता है। पूरे कोक्लेया के अच्छी तरह से संरेखित सीरियल अनुभागों के परिणामस्वरूप 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और मात्रात्मक विश्लेषण (यानी, लंबाई, चौड़ाई, सतह, मात्रा और संख्या) के लिए अलग-अलग संरचनाओं के त्रि-आयामी (3 डी) वॉल्यूम रेंडरिंग और विभाजन के लिए छवियों का ढेर होता है। कोचले को न्यूनतम प्रसंस्करण चरणों (निर्धारण, डिकैल्सीफिकेशन, निर्जलीकरण, धुंधलापन और ऑप्टिकल समाशोधन) की आवश्यकता होती है, जिनमें से सभी स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा बाद में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ संगत होते हैं। चूंकि सभी ऊतक ढेर में मौजूद हैं, इसलिए प्रत्येक संरचना का मूल्यांकन व्यक्तिगत रूप से या अन्य संरचनाओं के सापेक्ष किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि इमेजिंग फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करती है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और लिगैंड बाइंडिंग का उपयोग विशिष्ट संरचनाओं और कोक्लेया के भीतर उनके 3 डी वॉल्यूम या वितरण की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। यहां हमने बालों की कोशिकाओं और सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स के नुकसान को मापने के लिए वृद्ध चूहों से कोचले की जांच करने के लिए टीएसएलआईएम का उपयोग किया। इसके अलावा, उन्नत विश्लेषण (जैसे, क्लस्टर विश्लेषण) का उपयोग इसके 3 डी वॉल्यूम के साथ रोसेंथल की नहर में सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स की स्थानीय कटौती की कल्पना करने के लिए किया गया था। ये दृष्टिकोण कोचले के भीतर और बीच संरचना-कार्य संबंधों को निर्धारित करने के लिए टीएसएलआईएम माइक्रोस्कोपी की क्षमता को प्रदर्शित करते हैं।
Introduction
कोक्लेया स्तनधारियों में सुनने के लिए परिधीय संवेदी अंग है। इसमें संवेदी और सहायक कोशिकाओं को दोहराने की एक जटिल सर्पिल शारीरिक रचना है जो ध्वनि कंपन का पता लगाने और सुनवाई की धारणा के लिए उन्हें मस्तिष्क में संचारित करने के लिए शारीरिक रूप से विशिष्ट हैं। मुख्य संवेदी तत्व आंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाएं और उनके आंतरिक तंत्रिका फाइबर हैं जिनके कोशिका शरीर सर्पिल नाड़ीग्रन्थि की रचना करते हैं, जो रोसेंथल की नहर के भीतर रहता है (चित्रा 1)। इन संवेदी और तंत्रिका संरचनाओं को टोनोटोपिक रूप से व्यवस्थित किया जाता है जैसे कि उच्च आवृत्ति ध्वनियों को कॉक्लियर बेस में ट्रांसड्यूस किया जाता है और कम आवृत्ति वाली ध्वनियों को कोक्लेया एपेक्स2 में ट्रांसड्यूस किया जाता है। सहायक बेसिलर झिल्ली की सर्पिल लंबाई के साथ इस संवेदी कोशिका वितरण के एक शारीरिक मानचित्र को साइटोकोक्लेओग्राम3 कहा जाता है और इसकी तुलना ऑडियोग्राम में दर्शाए गए आवृत्ति के कार्य के रूप में श्रवण हानि के साथ की जा सकती है।
कोक्लेया की झिल्लीदार भूलभुलैया, जो घनी हड्डी से घिरा हुआ है, एक समय में एक से अधिक कॉक्लियर संरचना की जांच करना तकनीकी रूप से मुश्किल बनाता है। इसलिए, एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप विकसित करने का तर्क पूर्ण कोक्लेया के अच्छी तरह से संरेखित सीरियल वर्गों का उत्पादन करना है ताकि 3 डी पुनर्निर्माण में एक दूसरे के सापेक्ष सभी कॉक्लियर संरचनाओं की जांच की जा सके। Voie et al.4 और Voie and Spelman5 ने पहले प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप को डिजाइन किया, जिसे ऑर्थोगोनल प्लेन फ्लोरेसेंस ऑप्टिकल सेक्शनिंग (OPFOS) माइक्रोस्कोप कहा जाता है, जो पूरे कोक्लेया को ऑप्टिकल रूप से विभाजित करता है। हालांकि, इस माइक्रोस्कोप को व्यावसायिक रूप से कभी विकसित नहीं किया गया था; इसलिए, हमारा उद्देश्य एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप का निर्माण करना था जिसे पतली शीट लेजर इमेजिंग माइक्रोस्कोप (टीएसएलआईएम) कहा जाता है; चित्र 2)। टीएसएलआईएम के लिए डिजाइन और निर्माण विवरण पहले प्रकाशित किए गएहैं। टीएसएलआईएम ने ओपीएफओएस पर कई सुधार किए, जिसमें छवि संग्रह के लिए कम रोशनी वाले डिजिटल कैमरा बनाम सीसीडी कैमरे का उपयोग करना, प्रकाश-शीट के माध्यम से नमूने के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आंदोलन के लिए ऑप्टिकल रूप से एन्कोडेड माइक्रोपोजिशनर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट नमूना कक्ष का उपयोग करना और ऊतक के भीतर दाग वर्षा को रोकने के लिए समाशोधन समाधान के बजाय इथेनॉल में रोडामाइन धुंधला होना शामिल है। एसपीआईएम6 जैसे प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के वाणिज्यिक विकास ने जीवित, छोटे पारदर्शी नमूनों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन पूरे कॉक्लियर इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त हैं क्योंकि उनके पास पर्याप्त कार्य दूरी की कमी है। अन्य प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के विकास की समीक्षा सैंटी7 द्वारा प्रकाशित की गई थी। कोक्लेया की जांच करने के लिए अन्य हिस्टोलॉजिकल विधियों पर टीएसएलआईएम का प्राथमिक लाभ नमूने की अखंडता को संरक्षित करते हुए 3 डी पुनर्निर्माण के लिए ऊतकों को ऑप्टिकल रूप से खंड करना है ताकि इसका उपयोग अन्य हिस्टोलॉजिकल तरीकों द्वारा किया जा सके। टीएसएलआईएम इमेजिंग का एक और लाभ यह है कि लेजर द्वारा उत्पादित केवल एक पतली प्रकाश-शीट ऊतक के संपर्क में आती है, जिसकी तुलना में पूरे ऊतक मोटाई लेजर के संपर्क में आती है जैसा कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में होता है। प्रकाश फैलाव को कम करने के लिए ऊतक समाशोधन और यह तथ्य कि ऊतक का केवल एक छोटा सा हिस्सा लेजर के संपर्क में आता है, प्रकाश-शीट लेजर इमेजिंग के साथ न्यूनतम फ्लोरोक्रोम लुप्त (फोटोब्लीचिंग) का परिणाम होता है। हालांकि, निर्धारण, निर्जलीकरण और समाशोधन की प्रक्रिया कॉक्लियर संरचनाओं की आकृति विज्ञान को बदल देती है और इसके परिणामस्वरूप जीवित ऊतक की तुलना में ऊतक संकोचन होता है। ऊतक संकोचन की वास्तविक मात्रा जो होती है वह निर्धारित नहीं की गई थी।
टीएसएलआईएम शेन जॉनसन और आठ जर्मन ऑप्टिकल इंजीनियरिंग छात्रों द्वारा विकसित किया गया था ( पावती देखें)। टीएसएलआईएम निर्माण विवरण सैंटी एट अल.8 द्वारा प्रदान किए गए थे और श्रोटर एट अल.9 द्वारा एक स्कैनिंग संस्करण (एसटीएसएलआईएम) प्रदान किया गया था। टीएसएलआईएम ऑप्टिकल रूप से खंड नमूनों के लिए एक गैर-विनाशकारी माइक्रोटोम के रूप में कार्य करता है और कोक्लेया की पूर्ण चौड़ाई और मोटाई के माध्यम से 2 डी सीरियल अनुभागों को इकट्ठा करने के लिए माइक्रोस्कोप के रूप में कार्य करता है। टीएसएलआईएम छोटे (मिमी) और बड़े (सेमी), मोटे नमूने दोनों की छवि बना सकता है। लेंस को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर 1x और 2x के संग्रह उद्देश्यों के साथ लंबी कामकाजी दूरी के लिए अनुमति देने के लिए एयर माउंट किया जाता है। विच्छेदन माइक्रोस्कोप में ज़ूम ऑप्टिक्स भी होते हैं जो टीएसएलआईएम को कोशिकाओं पर उपकोशिकीय और सिनैप्टिक संरचनाओं को हल करने की अनुमति देते हैं। टीएसएलआईएम रोशनी के लिए नीले (473 एनएम) और हरे (532 एनएम) लेजर दोनों से लैस है जो इमेजिंग के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करने की अनुमति देता है। टीएसएलआईएम का लक्ष्य कॉक्लियर ऊतकों के पूर्ण डिजिटल पुनर्निर्माण के लिए एक पूरे कोक्लेया के माध्यम से अच्छी तरह से संरेखित 2 डी ऑप्टिकल वर्गों का उत्पादन करना है। चूंकि यह एक फ्लोरोसेंट विधि है, लिगैंड और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग विशिष्ट कॉक्लियर संरचनाओं की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।
प्रारंभ में, एक बेलनाकार लेंस का उपयोग दो विरोधी गॉसियन प्रकाश चादरों का उत्पादन करने के लिए किया गया था, लेकिन इसने अवशोषण इमेजिंग कलाकृतियों का उत्पादन किया। केलर एट अल .10 के काम के कारण, निश्चित बेलनाकार लेंस को प्रकाश शीट9 का उत्पादन करने के लिए स्कैनिंग गैल्वेनोमीटर दर्पण द्वारा बदल दिया गया था। इसके अलावा, चूंकि प्रकाश शीट का केंद्र बीम कमर पर सबसे पतला होता है, इसलिए एसटीएसएलआईएम 2 डी छवियों को नमूने की चौड़ाई में डेटा के एक्स-अक्ष कॉलम के समग्र को एकत्र करके उत्पादित किया जाता है (चित्रा 3)। इस विधि को पहली बार Buytaert और Dircks11 द्वारा वर्णित किया गया था। उपकरण नियंत्रण के लिए ग्राफिकल प्रोग्राम का उपयोग करके छवियों को चलाने और एकत्र करने के लिए टीएसएलआईएम कस्टम सॉफ्टवेयर विकसित किया गया था। प्रकाश शीट नमूने के माध्यम से यात्रा करती है और ऊतक के भीतर एक फ्लोरोसेंट विमान को रोशन करती है। इस फ्लोरोसेंट विमान को पारदर्शी नमूने के माध्यम से ऑर्थोगोनल रूप से प्रक्षेपित किया जाता है और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप द्वारा एकत्र किया जाता है। ऑप्टिकल रूप से एन्कोडेड माइक्रोपोजिशनर एक्स-अक्ष में बीम कमर के माध्यम से स्कैनिंग को एक समग्र 2 डी छवि एकत्र करने की अनुमति देते हैं और बाद में, जेड-अक्ष माइक्रोपोजिशनर नमूना को ऊतक के भीतर एक गहरे तल पर ले जाता है ताकि सीरियल, अनुभागित 2 डी छवियों का ढेर प्राप्त किया जा सके (वीडियो 1, चित्रा 4)। ट्रांसलेशनल छवियों का एक ढेर कोक्लेया की पूरी चौड़ाई, मोटाई और लंबाई के माध्यम से एकत्र किया जाता है, और छवियों की सिलाई की आवश्यकता नहीं होती है (वीडियो 2)। छवि स्टैक को दूसरे कंप्यूटर पर स्थानांतरित किया जाता है और 3 डी पुनर्निर्माण और परिमाणीकरण के लिए 3 डी रेंडरिंग प्रोग्राम में लोड किया जाता है। छवि स्टैक में माइक्रोस्कोप के संकल्प पर एक कोक्लेया की आकृति विज्ञान के बारे में सभी डिजिटल जानकारी होती है। हालांकि, अगर एक उच्च रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, तो बरकरार कोक्लेया को विनाशकारी हिस्टोलॉजिकल तरीकों जैसे माइक्रोटोम सेक्शनिंग, स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आगे संसाधित किया जा सकता है।
3 डी रेंडरिंग प्रोग्राम का उपयोग 3 डी रेंडरिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विभिन्न कॉक्लियर संरचनाओं को विभाजित करने के लिए किया जाता है। विभाजन के लिए, स्टैक की प्रत्येक 2 डी छवि में प्रत्येक संरचना को ग्राफिक्स टैबलेट और पेन (चित्रा 5) द्वारा एक अलग रंग का उपयोग करके पता लगाया जाता है। आज तक, 20 विभिन्न कॉक्लियर संरचनाओं को विभाजित किया गया है (चित्रा 6)। विभाजन के बाद, विभिन्न प्रकार के 3 डी विश्लेषण किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर संरचना के केन्द्रक के साथ किसी भी विमान में कोक्लेया को वस्तुतः अलग कर सकता है। वीडियो 3 में कोर्टी के अंग को स्पर्शरेखा को विभाजित करते हुए दिखाया गया है, जो बेसिलर झिल्ली की लंबाई के साथ बालों की कोशिकाओं को प्रकट करता है। इस प्रक्रिया को पहले ब्याज की संरचना के मैनुअल विभाजन की आवश्यकता होती है। इसके बाद, संरचना के केन्द्रक की गणना संरचना के केंद्र के साथ उसके आधार से इसके शीर्ष तक रखे गए स्प्लिन बिंदुओं के कम से कम वर्गों के आधार पर की जाती है, इस प्रकार संरचना की लंबाई के सन्निकटन की अनुमति मिलती है (वीडियो 4)। कंकालीकरण नामक एक समान प्रक्रिया का उपयोग रंग मानचित्र (वीडियो 4) का उपयोग करके इसकी लंबाई के साथ संरचना की रेडियल चौड़ाई की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। विभाजन के बाद प्रत्येक संरचना की कुल मात्रा की गणना प्रोग्राम द्वारा की जाती है, लेकिन सापेक्ष दूरी को 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 7) में रंग मानचित्रों के साथ परिमाणित और कल्पना भी की जा सकती है। खंडित संरचनाओं को बढ़े हुए, ठोस-प्लास्टिक मॉडल रेंडरिंग (चित्रा 8) का उत्पादन करने के लिए भी निर्यात किया जा सकता है। इसके अलावा, अर्ध-स्वचालित सेल गिनती 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 9) का उपयोग करके भी की जा सकती है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और लिगैंड बाइंडिंग का उपयोग विशिष्ट कॉक्लियर संरचनाओं को दागने के लिए किया जा सकता है और इन संरचनाओं को मोर्फोमेट्रिकल मूल्यांकन के लिए अन्य कॉक्लियर संरचनाओं से अलग किया जा सकता है जैसे कि साइटोकोक्लेओग्राम का उत्पादन (चित्रा 10)। लंबाई, चौड़ाई, सतह, मात्रा और सभी कॉक्लियर संरचनाओं की संख्या 3 डी मॉडल से निर्धारित की जा सकती है, जिससे यह दृष्टिकोण कार्यात्मक हानि के लिए कॉक्लियर क्षति के मानचित्रण के लिए आदर्श हो जाता है। विशेष रूप से, उम्र बढ़ने, शोर-प्रेरित आघात, या अन्य अपमान के कारण कॉक्लियर क्षति को 2 डी ऑप्टिकल वर्गों से 3 डी कॉक्लियर पुनर्निर्माण में दिखाया और परिमाणित किया जा सकता है। एक बार जब एक कोक्लेया को डिजिटाइज़ कर दिया जाता है तो कई इमेजिंग एल्गोरिदम होते हैं जिनका उपयोग अन्य कॉक्लियर ऊतकों के लिए शारीरिक रजिस्ट्री में कोक्लेया के भीतर किसी भी ऊतक के कॉक्लियर क्षति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कॉक्लियर संरचनाओं की परीक्षा के लिए लाइट शीट माइक्रोस्कोपी द्वारा ऑप्टिकल सेक्शनिंग अन्य पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल विधियों की तरह यांत्रिक रूप से विनाशकारी नहीं है, और यह एक दूसरे के सापेक्ष कॉक्लियर ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के बधिरता और अन्य संचार विकारों पर राष्ट्रीय संस्थान, केलॉग फाउंडेशन और ब्रिजेट स्परल और जॉन मैककॉर्मिक से निजी दान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है। टीएसएलआईएम को मैथियास हिलेनब्रांड, केर्स्टिन जॉन, मीके लॉइन, मिशेल लेहर, टोबियास श्रोएटर, पीटर शैच, ओलिवर डैनबर्ग और जूलियन वुस्टर की उत्कृष्ट सहायता से विकसित किया गया है।
Materials
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
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