Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi
Summary
Tüm kokleayı görüntülemek ve dijitalleştirmek için bir ışık tabakası mikroskobu geliştirilmiştir.
Abstract
Sağırlık, Dünya Sağlık Örgütü1’e göre dünya çapında yaklaşık% 5 veya 430 milyon insanı etkileyen en yaygın duyusal bozukluktur. Yaşlanma veya presbycusis, sensörinöral işitme kaybının birincil nedenidir ve saç hücrelerine, spiral ganglion nöronlarına (SGN’ler) ve stria vascularis’e verilen hasar ile karakterizedir. Bu yapılar, sıvı içinde asılı duran ve kemikle çevrili membranöz dokuların karmaşık, spiral şekilli bir anatomisine sahip olan kokleanın içinde bulunur. Bu özellikler, histopatolojik değişikliklerin araştırılmasını ve ölçülmesini teknik olarak zorlaştırmaktadır. Bu ihtiyacı karşılamak için, iç kulaktaki yapı-fonksiyon ilişkilerinin incelenmesini kolaylaştırmak için tüm kokleayı görüntüleyebilen ve dijitalleştirebilen bir ışık tabakası mikroskobu (TSLIM) geliştirdik. Tüm kokleanın iyi hizalanmış seri bölümleri, üç boyutlu (3B) hacim oluşturma ve 3B görselleştirme ve nicel analiz (yani uzunluk, genişlik, yüzey, hacim ve sayı) için ayrı ayrı yapıların segmentasyonu için bir görüntü yığını oluşturur. Kokleae, minimum işlem adımlarına (fiksasyon, kireç giderme, dehidrasyon, boyama ve optik temizleme) ihtiyaç duyar ve bunların hepsi tarama ve iletim elektron mikroskobu ile sonraki yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile uyumludur. Tüm dokular yığınlarda bulunduğundan, her yapı ayrı ayrı veya diğer yapılara göre değerlendirilebilir. Ek olarak, görüntüleme floresan problar kullandığından, immünohistokimya ve ligand bağlama, spesifik yapıları ve bunların koklea içindeki 3D hacmini veya dağılımını tanımlamak için kullanılabilir. Burada, saç hücrelerinin ve spiral ganglion nöronlarının kaybını ölçmek için yaşlı farelerden kokleaları incelemek için TSLIM’i kullandık. Ek olarak, Rosenthal kanalındaki spiral ganglion nöronlarının 3D hacmi boyunca lokal olarak azalmalarını görselleştirmek için gelişmiş analizler (örneğin, küme analizi) kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar, TSLIM mikroskopisinin koklea içindeki ve arasındaki yapı-fonksiyon ilişkilerini ölçme yeteneğini göstermektedir.
Introduction
Koklea, memelilerde işitme için periferik duyu organıdır. Ses titreşimlerini tespit etmek ve işitme algısı için beyne iletmek için anatomik olarak uzmanlaşmış tekrarlayan duyusal ve destekleyici hücrelerin karmaşık bir spiral anatomisine sahiptir. Ana duyusal elementler, Rosenthal kanalında bulunan spiral ganglionu oluşturan hücre gövdeleri olan iç ve dış kıl hücreleri ve bunların sinir bozucu sinir lifleridir (Şekil 1). Bu duyusal ve nöral yapılar, yüksek frekanslı seslerin koklear tabanda ve düşük frekanslı seslerin koklea tepe2’de dönüştürüleceği şekilde tonotopik olarak düzenlenmiştir. Destekleyici baziler membranın spiral uzunluğu boyunca bu duyusal hücre dağılımının anatomik bir haritasına sitokokogram3 denir ve bir odyogramda gösterildiği gibi frekansın bir fonksiyonu olarak işitme kaybı ile karşılaştırılabilir.
Yoğun kemikle çevrili kokleanın membranöz labirenti, aynı anda birden fazla koklear yapının incelenmesini teknik olarak zorlaştırır. Bu nedenle, bir ışık tabakası mikroskobu geliştirmenin mantığı, tüm kokleanın iyi hizalanmış seri bölümlerini üretmektir, böylece tüm koklear yapılar 3D rekonstrüksiyonlarda birbirlerine göre incelenebilir. Voie et al.4 ve Voie ve Spelman5 , tüm kokleayı optik olarak bölümlemek için ortogonal düzlem floresan optik kesitleme (OPFOS) mikroskobu adı verilen ilk ışık tabakası mikroskobunu tasarladı. Bununla birlikte, bu mikroskop hiçbir zaman ticari olarak geliştirilmemiştir; Bu nedenle, amacımız ince tabaka lazer görüntüleme mikroskobu (TSLIM; Şekil 2). TSLIM için tasarım ve yapım detayları daha önce yayınlanmış8. TSLIM, görüntü toplama için düşük ışıklı bir dijital kameraya karşı bir CCD kameranın kullanılması, numunenin ışık tabakası boyunca doğru ve tekrarlanabilir hareketi için optik olarak kodlanmış mikro konumlandırıcılar, ticari olarak temin edilebilen, optik olarak berrak bir numune odasının kullanılması ve doku içinde leke çökelmesini önlemek için temizleme çözeltisi yerine etanolde Rodamin boyaması dahil olmak üzere OPFOS üzerinde çeşitli iyileştirmeler yaptı. SPIM6 gibi hafif tabaka mikroskoplarının ticari gelişimi, canlı, küçük şeffaf örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine odaklanmıştır, ancak yeterli çalışma mesafesine sahip olmadıkları için tüm koklear görüntüleme için uygun değildir. Diğer ışık tabakası mikroskoplarının gelişiminin bir incelemesi Santi7 tarafından yayınlandı. TSLIM’in kokleayı incelemek için diğer histolojik yöntemlere göre birincil avantajı, diğer histolojik yöntemlerle kullanılabilmesi için numunenin bütünlüğünü korurken, 3D rekonstrüksiyon için dokuları optik olarak kesitlemektir. TSLIM görüntülemenin bir diğer avantajı, konfokal mikroskopide olduğu gibi lazere tüm doku kalınlığının maruz kalmasıyla karşılaştırıldığında, bir lazer tarafından üretilen sadece ince bir ışık tabakasının dokuya maruz kalmasıdır. Işık saçılımını en aza indirmek için doku temizleme ve dokunun sadece küçük bir kısmının lazere maruz kalması, ışık tabakası lazer görüntüleme ile minimum florokrom solma (fotobeyazlatma) ile sonuçlanır. Bununla birlikte, fiksasyon, dehidrasyon ve temizleme işlemi, koklear yapıların morfolojisini değiştirir ve canlı dokuya kıyasla doku büzülmesine neden olur. Meydana gelen doku büzülmesinin gerçek miktarı belirlenmemiştir.
TSLIM, Shane Johnson ve sekiz Alman optik mühendisliği öğrencisi tarafından geliştirilmiştir (bkz. TSLIM inşaat detayları Santi ve ark.8 ve Schröter ve ark.9 tarafından bir tarama versiyonu (sTSLIM) sağlanmıştır. TSLIM, optik olarak kesit örnekleri için tahribatsız bir mikrotom olarak ve kokleanın tam genişliği ve kalınlığı boyunca 2D seri kesitleri toplamak için bir mikroskop olarak işlev görür. TSLIM hem küçük (mm) hem de büyük (cm), kalın örnekleri görüntüleyebilir. Lensler, diseksiyon mikroskobunda 1x ve 2x toplama hedefleriyle uzun çalışma mesafelerine izin vermek için havaya monte edilir. Diseksiyon mikroskobu ayrıca TSLIM’in hücreler üzerindeki hücre altı ve sinaptik yapıları çözmesine izin veren zoom optiklerine sahiptir. TSLIM, görüntüleme için çeşitli floresan probların kullanılmasına izin veren aydınlatma için hem mavi (473 nm) hem de yeşil (532 nm) lazer ile donatılmıştır. TSLIM’in amacı, koklear dokuların tam bir dijital rekonstrüksiyonu için bütün bir koklea aracılığıyla iyi hizalanmış 2D optik bölümler üretmektir. Bir floresan yöntemi olduğundan, spesifik koklear yapıları tanımlamak için ligandlar ve immünohistokimya da kullanılabilir.
Başlangıçta, iki karşıt Gauss ışık tabakası üretmek için silindirik bir lens kullanıldı, ancak absorpsiyon görüntüleme eserleri üretti. Keller ve ark.10’un çalışmaları nedeniyle, sabit silindirik lens, ışık tabakası9’u üretmek için bir tarama galvanometre aynası ile değiştirildi. Ek olarak, ışık tabakasının merkezi ışın belindeki en ince olduğu için, sTSLIM 2D görüntüler, numunenin genişliği boyunca X ekseni veri sütunlarının bir bileşimi toplanarak üretilir (Şekil 3). Bu yöntem ilk olarak Buytaert ve Dircks11 tarafından tanımlanmıştır. Görüntüleri sürmek ve toplamak için TSLIM özel yazılımı, enstrüman kontrolü için grafiksel bir program kullanılarak geliştirilmiştir. Işık tabakası numune boyunca hareket eder ve doku içindeki bir floresan düzlemi aydınlatır. Bu floresan düzlem, şeffaf numune boyunca ortogonal olarak yansıtılır ve bir diseksiyon mikroskobu ile toplanır. Optik olarak kodlanmış mikro konumlandırıcılar, tek bir kompozit 2D görüntü toplamak için X eksenindeki ışın belinden taramaya izin verir ve daha sonra, Z ekseni mikropozisyoner, seri, kesitli 2D görüntülerin bir yığınını elde etmek için numuneyi doku içinde daha derin bir düzleme taşır (Video 1, Şekil 4). Kokleanın tüm genişliği, kalınlığı ve uzunluğu boyunca bir translasyonel görüntü yığını toplanır ve görüntülerin dikilmesi gerekmez (Video 2). Görüntü yığını başka bir bilgisayara aktarılır ve 3B yeniden yapılandırma ve niceleme için bir 3B oluşturma programına yüklenir. Görüntü yığınları, mikroskop çözünürlüğünde bir kokleanın morfolojisi hakkındaki tüm dijital bilgileri içerir. Bununla birlikte, daha yüksek bir çözünürlük gerekirse, sağlam koklea mikrotom kesitleme, tarama ve transmisyon elektron mikroskobu gibi yıkıcı histolojik yöntemlerle daha fazla işlenebilir.
3B görüntüleme programı, 3B işleme ve kantitatif analiz için farklı koklear yapıları segmentlere ayırmak için kullanılır. Segmentasyon için, yığının her 2B görüntüsündeki her yapı, bir grafik tablet ve kalem tarafından farklı bir renk kullanılarak izlenir (Şekil 5). Bugüne kadar 20 farklı koklear yapı segmentlere ayrılmıştır (Şekil 6). Segmentasyondan sonra çeşitli 3D analizler yapılabilir. Örneğin, 3D render yazılımı, kokleayı yapının merkezi boyunca herhangi bir düzlemde neredeyse rezeksiyon edebilir. Video 3 , baziler zarın uzunluğu boyunca saç hücrelerini ortaya çıkaran Corti organına teğetsel kesitleri göstermektedir. Bu süreç öncelikle ilgilenilen yapının manuel olarak bölümlendirilmesini gerektirir. Daha sonra, yapının merkezcilliği, yapının merkezi boyunca tabanından tepesine kadar yerleştirilen spline noktalarının en küçük karelere uymasına dayanarak hesaplanır ve böylece yapının uzunluğunun yaklaşmasına izin verilir (Video 4). İskeletleşme adı verilen benzer bir işlem, yapının radyal genişliğini uzunluğu boyunca bir renk haritası kullanarak görselleştirmek için kullanılabilir (Video 4). Her yapının toplam hacmi, segmentasyondan sonra program tarafından hesaplanır, ancak göreceli mesafeler de bir 3B oluşturma yazılımında renk haritaları ile ölçülebilir ve görselleştirilebilir (Şekil 7). Segmentli yapılar, büyütülmüş, katı plastik model işlemeleri üretmek için de dışa aktarılabilir (Şekil 8). Ek olarak, yarı otomatik hücre sayımı 3D render yazılımı kullanılarak da gerçekleştirilebilir (Şekil 9). İmmünohistokimya ve ligand bağlanması, spesifik koklear yapıları boyamak için kullanılabilir ve bu yapılar, sitokokoleogram üretmek gibi morfometrik değerlendirme için diğer koklear yapılardan izole edilebilir (Şekil 10). Tüm koklear yapıların uzunluğu, genişliği, yüzeyi, hacmi ve sayısı 3B modellerden belirlenebilir, bu da koklear hasarı fonksiyonel bozukluklara eşlemek için idealdir. Özellikle, yaşlanma, gürültüye bağlı travma veya diğer hakaretlere bağlı koklear hasar, 2D optik bölümlerden 3D koklear rekonstrüksiyonlarda gösterilebilir ve ölçülebilir. Bir koklea sayısallaştırıldıktan sonra, anatomik kayıt defterindeki koklea içindeki herhangi bir dokunun koklear hasarı diğer koklear dokulara göre değerlendirmek için kullanılabilecek çok sayıda görüntüleme algoritması vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koklear yapıların incelenmesi için ışık tabakası mikroskobu ile optik kesitleme, diğer geleneksel histolojik yöntemler gibi mekanik olarak yıkıcı değildir ve koklear yapıların birbirine göre tam bir dijital görünümünü sağlar. Corti14 organının yüzey preparatları gibi önceki yöntemler, baziler zarın uzunluğu boyunca saç hücresi kaybının bir haritasını sağladı, ancak doku Corti organını ortaya çıkarmak için diseke edildiğinden SGN kaybı değerlendirilemed…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Kellogg Vakfı ve Bridget Sperl ve John McCormick’in özel bağışlarıyla desteklenmiştir. TSLIM, Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg ve Julian Wuester’in Illmenau Teknik Üniversitesi’nden mükemmel yardımlarıyla, akıl hocaları (Stefan Sinzinger ve Rene Theska) ve James Leger’in gözetiminde geliştirilmiştir.
Materials
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021)
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. The digital cytocochleogram. Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. . On making human and animal preparations transparent. , (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
