L’avanzamento dello studio della follicologenesi preantrale richiede metodi efficienti di isolamento del follicolo dalle singole ovaie. Qui viene presentato un protocollo meccanico semplificato per l’isolamento del follicolo dalle ovaie bovine utilizzando un tritatutto tissutale e un omogeneizzatore. Questo metodo consente la raccolta di un gran numero di follicoli preantrali vitali da una singola ovaia.
Comprendere l’intero processo della follicologenesi dei mammiferi è fondamentale per migliorare le tecnologie di riproduzione assistita nel bestiame, negli esseri umani e nelle specie in via di estinzione. La ricerca è stata per lo più limitata ai follicoli antrali e ai grandi follicoli preantrali a causa della difficoltà nell’isolamento dei follicoli preantrali più piccoli, specialmente nei grandi mammiferi come le specie bovine. Questo lavoro presenta un approccio efficiente per recuperare un gran numero di piccoli follicoli preantrali da un singolo ovaio bovino. La corteccia delle singole ovaie bovine è stata tagliata in cubi da 500 μm utilizzando un trinciatutto di tessuto e omogeneizzata per 6 minuti a 9.000-11.000 giri / min utilizzando una sonda da 10 mm. I detriti di grandi dimensioni sono stati separati dall’omogenato usando un panno di formaggio, seguito da una filtrazione seriale attraverso filtri cellulari da 300 μm e 40 μm. Il contenuto trattenuto nel filtro da 40 μm è stato risciacquato in un piatto di ricerca, dove i follicoli sono stati identificati e raccolti in una goccia di mezzo. La vitalità dei follicoli raccolti è stata testata tramite colorazione blu tripano. Questo metodo consente l’isolamento di un gran numero di piccoli follicoli preantrali vitali da un singolo ovaio bovino in circa 90 minuti. È importante sottolineare che questo metodo è interamente meccanico ed evita l’uso di enzimi per dissociare il tessuto, che può danneggiare i follicoli. I follicoli ottenuti utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per applicazioni a valle come l’isolamento dell’RNA per RT-qPCR, l’immunolocalizzazione di proteine specifiche e la coltura in vitro .
I follicoli ovarici sono le unità funzionali dell’ovaio, responsabili della produzione del gamete (ovocita) e degli ormoni critici per la funzione riproduttiva e la salute generale. I follicoli primordiali si formano nell’ovaio durante lo sviluppo fetale o nel periodo neonatale a seconda della specie1 e costituiscono la riserva ovarica di una femmina. La crescita follicolare inizia con l’attivazione dei follicoli primordiali che lasciano il pool di riposo ed entrano nella fase di crescita. La follicologenesi preantrale, che comprende tutti gli stadi follicolari prima dello sviluppo dell’antro, è un processo altamente dinamico che richiede cambiamenti morfologici e metabolici sincroni nell’ovocita e nelle cellule della granulosa circostante, guidati da una stretta comunicazione tra questi due tipi di cellule 2,3. I follicoli preantrali costituiscono la maggior parte delle unità follicolari presenti nell’ovaio in un dato momento4. Lo sviluppo attraverso gli stadi preantrali della follicologenesi è stimato in diverse settimane più lungo dello sviluppo antrale 5,6, e questo tempo è necessario affinché l’ovocita e le cellule somatiche acquisiscano una maturità sufficiente per entrare nella fase finale di sviluppo (cioè la fase antrale) e prepararsi per l’ovulazione, la fecondazione e lo sviluppo embrionale 7,8,9.
Gran parte delle attuali conoscenze sulla follicologenesi preantrale ovarica proviene dai modelli murini10,11,12,13, dovuta in parte alla facilità nel recuperare un gran numero di questi follicoli da un ovaio più piccolo e meno fibroso. Sebbene le segnalazioni di isolamento di un gran numero di follicoli preantrali dalle ovaie bovine risalgano a circa 30 anni14, una comprensione più completa dei processi che regolano lo sviluppo di questi follicoli in fase iniziale è rimasta irrealizzata, in gran parte a causa della mancanza di metodi ottimizzati, efficienti e ripetibili per recuperare un numero sufficiente di follicoli preantrali vitali, in particolare nelle prime fasi dello sviluppo. Con il crescente interesse a preservare la riserva ovarica per un uso futuro nella riproduzione assistita nell’uomo, le mucche diventano un modello attraente grazie alla loro struttura ovarica più simile15. Tuttavia, l’ovaio bovino è marcatamente più ricco di collagene rispetto all’ovaio di topo16, rendendo l’isolamento meccanico utilizzando i metodi descritti per il topo molto inefficiente. Gli sforzi per espandere le tecniche di conservazione della fertilità includono la crescita completa in vitro dei follicoli preantrali allo stadio antrale, seguita dalla maturazione in vitro (IVM) degli ovociti chiusi, dalla fecondazione in vitro (IVF) e dalla produzione e trasferimento di embrioni17. Finora, l’intero processo è stato raggiunto solo nei topi18. Nei bovini, il progresso verso la crescita del follicolo in vitro è limitato a pochi rapporti con stadi follicolari variabili all’inizio della coltura, così come lunghezza variabile della coltura tra i protocolli17,19.
I metodi descritti in letteratura per il prelievo di follicoli preantrali dall’ovaio bovino hanno utilizzato principalmente tecniche meccaniche ed enzimatiche, isolate o in combinazione 2,14,17,20. Il primo rapporto di un protocollo per l’isolamento del follicolo preantrale bovino ha utilizzato un omogeneizzatore tissutale e una filtrazione seriale per elaborare le ovaie intere20. Questo studio è stato seguito da rapporti che combinano procedure meccaniche ed enzimatiche che utilizzavano la collagenasi14. Un tema ricorrente quando si utilizza la collagenasi per digerire il tessuto ovarico è il potenziale rischio di danni alla membrana basale follicolare, che può compromettere la vitalità del follicolo 14,21,22,23. Pertanto, sono state impiegate diverse combinazioni di metodi meccanici, come l’uso di un trinciatutto e pipettaggio ripetuto o di un trinciatutto combinato con omogeneizzazione20,24,25,26. Un’altra tecnica meccanica che è stata descritta utilizza aghi per sezionare i follicoli preantrali direttamente dal tessuto ovarico, che è particolarmente utile per isolare follicoli secondari più grandi (>200 μm). Tuttavia, questo processo richiede tempo, è inefficiente per isolare i follicoli preantrali più piccoli ed è dipendente dalle competenze quando viene tentato nelle ovaie bovine 19,27,28.
Sfruttando le diverse tecniche descritte in letteratura, questo protocollo mirava a ottimizzare l’isolamento dei follicoli preantrali dalle singole ovaie bovine in modo semplice, coerente ed efficiente che eviti l’incubazione in soluzioni enzimatiche. Il miglioramento dei metodi per isolare i follicoli preantrali fornirà l’opportunità di migliorare la comprensione di questo stadio della follicologenesi e consentirà lo sviluppo di sistemi di coltura efficaci per sviluppare follicoli preantrali allo stadio antrale. Le procedure dettagliate qui descritte per l’isolamento dei follicoli preantrali da un grande mammifero come la specie bovina saranno vitali per i ricercatori che mirano a studiare la follicologenesi precoce in una specie non murina che è traducibile per l’uomo.
Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile per recuperare i follicoli preantrali in fase iniziale, in particolare nelle fasi primarie e secondarie, dall’ovaio bovino. Questo protocollo si basa sui precedenti rapporti 20,25,30,34,35,36 e fornisce ottimizzazioni che si traducono nell’isolamento di un numero significativo di follicoli da una singola ovaia.…
The authors have nothing to disclose.
Questo progetto è stato parzialmente finanziato dal progetto multi-stato USDA W4112 e dal premio UC Davis Jastro Shields a SM.
Gli autori vorrebbero estendere il loro apprezzamento a Central Valley Meat, Inc. per aver fornito le ovaie bovine utilizzate in tutti gli esperimenti. Gli autori ringraziano anche Olivia Silvera per l’assistenza nell’elaborazione delle ovaie e nell’isolamento del follicolo.
5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
#21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |