Dotto biliare extraepatico e dissezione della cistifellea nei neonati di topo di nove giorni
Summary
Per l’osservazione dei disturbi del dotto biliare neonatale murino, sono necessari un dotto biliare intatto e una preparazione efficiente. Pertanto, è stato sviluppato con successo un nuovo approccio per isolare l’intero sistema dei dotti biliari extraepatici nei neonati murini mantenendo l’integrità del dotto biliare.
Abstract
La dissezione dei dotti biliari neonatali murini è stata descritta come difficile. L’obiettivo principale della procedura operativa standard descritta è l’isolamento del dotto biliare extraepatico (EBD) nei neonati di topo senza danneggiare il dotto biliare durante la preparazione. A causa della sua preparazione eccezionalmente stretta rispetto alla linea cellulare dei colangiociti e della raccolta dell’intero sistema dei dotti biliari extraepatici (EBDS), l’approccio descritto è estremamente utile nella ricerca di modelli animali di disturbi del dotto biliare neonatale, come l’atresia biliare. Dopo l’eutanasia, si è acceduto alla cavità peritoneale e il sistema del dotto biliare, il duodeno e il fegato sono stati estratti con l’esclusiva resezione in blocco (EbR). Il campione estratto viene posto su un tappetino di schiuma e l’EBD viene sezionato dalle cellule contaminanti in modo atraumatico senza il necessario contatto. La dissezione dell’intero EBDS è un vantaggio significativo di questo metodo. Bisogna fare attenzione a causa delle piccole dimensioni e della quantità di tessuto del dotto biliare. Usando la tecnica descritta, non vi è alcun danno ai colangiociti. Inoltre, la purezza della tecnica è riproducibile (n = 10). Pertanto, è possibile raccogliere campioni comparabili in modo ottimale. Inoltre, nessun tessuto del dotto biliare viene danneggiato, perché qualsiasi contatto con il sistema del dotto biliare può essere evitato durante la preparazione, lasciando il fluido biliare all’interno della cistifellea. Ancora più importante, durante l’esecuzione della dissezione finale della cistifellea e del dotto biliare, sono stati utilizzati microstrumenti atraumatici solo leggermente laterali del dotto biliare senza schiacciarlo. Questa è la chiave per un campione pulito e intatto, ed essenziale per ulteriori indagini istologiche o l’isolamento dei colangiociti. Per riassumere, l’innovativa tecnica di dissezione descritta consente agli operatori particolarmente inesperti con le attrezzature necessarie di isolare l’EBDS nel modo più pulito possibile.
Introduction
La genesi e la progressione delle colangiopatie come l’atresia biliare, la colangite sclerosante primitiva (PSC) e la colangite biliare primitiva (PBC) sono sconosciute o incomplete 1,2. La limitata comprensione dell’origine e della progressione di tali malattie porta ad una scarsità di opzioni terapeutiche3. L’ostacolo più difficile nello studio dei disturbi del dotto biliare neonatale è acquisire una comprensione molecolare della fisiopatologia. Una delle chiavi essenziali per una migliore comprensione della patologia molecolare è la migliore osservazione possibile del tessuto interessato. Per evitare una ridotta comparabilità e discrepanze tra le ricerche, come l’osservazione della potenziale eziologia virale dell’atresia biliare4, sorge la necessità della migliore preparazione e condivisione possibile delle tecniche di dissezione eseguite. Una preparazione pura del tessuto bersaglio è necessaria per successive indagini microscopiche o colture di cellule di riproduzione e organoidi 3D. Tuttavia, nei disturbi neonatali murini, i campioni di tessuto sono rari e si verificano solo in una piccola quantità a causa delle dimensioni molto ridotte. Per quanto riguarda i disturbi del dotto biliare, sono state descritte difficoltà in una preparazione pulita dei dotti biliari nei neonati murini5. A causa della fase neonatale dello sviluppo, la differenziazione tissutale non è eccessivamente avanzata, il che complica la preparazione e aumenta la difficoltà rispetto alla preparazione di campioni adulti. Pertanto, il gruppo di lavoro operativo ha studiato una nuova strategia per preparare l’EBDS in un modello murino neonatale. Nel presente studio, la tecnica consente una dissezione efficiente di ciascun campione.
Il sistema del dotto biliare è posizionato per via intraperitoneale nell’addome superiore destro, derivante dal fegato. La cistifellea si trova sotto la superficie viscerale del lobo destro del fegato. Il dotto biliare, insieme alla vena porta e all’arteria epatica, è incorporato nel legamento epatoduodenale. Si unisce direttamente al fegato e al duodeno e drena il fluido biliare nel duodeno6. Anatomicamente, il dotto biliare è diviso nei dotti epatici destro e sinistro, nel dotto epatico comune, nel dotto cistico e nel dotto choledochus, che è formato dalla confluenza del dotto cistico e del dotto epatico comune7. Questo alla fine svuota il fluido biliare e la saliva dal dotto pancreatico nel duodeno attraverso l’Ampulla di Vater.
I colangiociti rivestono il dotto biliare intra ed extraepaticamente, dimorando in una nicchia anatomica complicata dove aiutano nella produzione di bile e nell’omeostasi8. Il fluido biliare passa queste cellule epiteliali specializzate in alte concentrazioni ogni giorno. In particolare, il mantenimento dell’ombrello HCO3- è molto importante per la protezione contro la tossicità degli acidi biliari9. I colangiociti sono la prima linea di difesa nel sistema epatobiliare contro, ad esempio, i microrganismi luminali10. L’efficacia di difesa dei colangiociti contro gli assalti tossici può essere indebolita dalla predisposizione genetica. Un sovraccarico tossico provoca danni e distruzione e può quindi portare a colangiopatie. Inoltre, il dotto biliare in via di sviluppo non è completamente capace di tutti i meccanismi di autoprotezione, portando ad una maggiore suscettibilità alle tossine ambientali nei dotti biliari neonatali11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo ha riportato e discusso la creazione e la convalida di un nuovo approccio chirurgico per la rimozione dell’EBDS dei topi neonatali eutanasiatici. I risultati microscopici e istologici rivelano che l’approccio rileva rapidamente le EBD e le seziona vicino ai margini del dotto, anche nei topi neonatali. Per il protocollo descritto sono necessari solo strumenti chirurgici e un microscopio con un ingrandimento 20x. Inoltre, l’approccio consente l’isolamento dell’intero EBDS. La tecnica è altamente efficiente…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl e Magdalena Trochimiuk per i loro contributi. Hans Christian Schmidt è stato sostenuto finanziariamente dalla borsa di studio Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Amburgo.
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
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