Ekstrahepatisk gallegang og galleblæredisseksjon hos ni dager gamle mus nyfødte

Summary

For observasjon av murine neonatale gallekanalforstyrrelser, er det nødvendig med en intakt gallekanal og effektiv forberedelse. Derfor ble en ny tilnærming for å isolere hele det ekstrahepatiske gallekanalsystemet i murine nyfødte vellykket utviklet samtidig som gallekanalens integritet ble opprettholdt.

Abstract

Disseksjonen av murine neonatale gallekanaler har blitt beskrevet som vanskelig. Hovedmålet med den beskrevne standard operasjonsprosedyren er isolering av den ekstrahepatiske gallekanalen (EBD) hos musenyfødte uten å skade gallekanalen under tilberedning. På grunn av sin eksepsjonelt tette forberedelse sammenlignet med kolangiocyttcellelinjen og høsting av hele ekstrahepatisk gallekanalsystem (EBDS), er den beskrevne tilnærmingen ekstremt nyttig ved forskning på dyremodeller av nyfødte gallekanalforstyrrelser, som galde atresi. Etter eutanasi ble bukhulen tilgjengelig, og gallekanalsystemet, tolvfingertarmen og leveren ble ekstrahert med den unike En-bloc-Resection (EbR). Den ekstraherte prøven plasseres på en skummatte, og EBD dissekeres fra forurensende celler atraumatisk uten nødvendig berøring. Disseksjonen av hele EBDS er en betydelig fordel ved denne metoden. Forsiktighet må utvises på grunn av den lille størrelsen og mengden gallekanalvev. Ved hjelp av den beskrevne teknikken er det ingen skade på kolangiocytter. Videre er renheten av teknikken reproduserbar (n = 10). Derfor kan optimalt sammenlignbare prøver høstes. Videre er ingen gallekanalvev skadet, fordi enhver kontakt med gallekanalsystemet kan unngås under tilberedning, og etterlater gallevæsken inne i galleblæren. Viktigst, mens du utfører den endelige galleblæren og gallegangsdisseksjonen, ble atraumatiske mikroinstrumenter bare brukt litt lateral av gallekanalen uten å klemme den. Dette er nøkkelen til en ren og intakt prøve, og avgjørende for videre histologisk undersøkelse eller isolering av kolangiocytter. For å oppsummere, gjør den beskrevne innovative disseksjonsteknikken det mulig for spesielt uerfarne operatører med nødvendig utstyr å isolere EBDS så rent som mulig.

Introduction

Opprinnelsen og progresjonen av kolangiopatier som biliær atresi, primær skleroserende kolangitt (PSC) og primær biliær kolangitt (PBC) er enten ukjent eller ufullstendig ^1,2. Den begrensede forståelsen av opprinnelsen og progresjonen av disse sykdommene fører til mangel på behandlingsalternativer³. Det vanskeligste hinderet for å studere neonatale gallegangsforstyrrelser er å få en molekylær forståelse av patofysiologien. En av de viktigste nøklene til en bedre forståelse av molekylær patologi er best mulig observasjon av berørt vev. For å unngå redusert sammenlignbarhet og avvik mellom forskning, for eksempel å observere potensiell viral etiologi av biliær atresi⁴, oppstår behovet for best mulig forberedelse og deling av de utførte disseksjonsteknikkene. En ren fremstilling av målvevet er nødvendig for senere mikroskopiske undersøkelser eller avl av celle- og 3D-organoidkulturer. Men i murine neonatale lidelser er vevsprøver sjeldne og forekommer bare i liten mengde på grunn av den svært små størrelsen. Når det gjelder gallegangsforstyrrelser, er det beskrevet vanskeligheter med rent preparat av gallekanaler hos murine nyfødte⁵. På grunn av det neonatale utviklingsstadiet er vevsdifferensiering ikke altfor avansert, noe som kompliserer forberedelsen og øker vanskeligheten sammenlignet med utarbeidelsen av voksenprøver. Derfor undersøkte operasjonsarbeidsgruppen en ny strategi for å forberede EBDS i en neonatal musemodell. I denne studien tillater teknikken en effektivdisseksjon av hver prøve.

Gallekanalsystemet er intraperitonealt plassert i høyre øvre del av magen, som oppstår fra leveren. Galleblæren ligger under den viscerale overflaten av leverens høyre lobe. Gallekanalen, sammen med portalvenen og leverarterien, er innebygd i hepatoduodenal ligament. Den forbinder leveren og tolvfingertarmen direkte og drenerer gallevæske inn i tolvfingertarmen⁶. Anatomisk er gallekanalen delt inn i høyre og venstre leverkanaler, den vanlige leverkanalen, den cystiske kanalen og Ductus choledochus, som dannes ved sammenløpet av den cystiske kanalen og den vanlige leverkanalen⁷. Denne tømmer til slutt gallevæske og spytt fra bukspyttkjertelen inn i tolvfingertarmen via Ampulla of Vater.

Kolangiocytter strekker gallekanalen intra- og ekstrahepatisk, og bor i en komplisert anatomisk nisje hvor de bistår i galleproduksjon og homeostase⁸. Gallevæske passerer disse spesialiserte epitelceller i høye konsentrasjoner daglig. Spesielt er HCO3-paraplyvedlikeholdet svært viktig for å beskytte mot gallesyretoksisitet⁹. Kolangiocytter er den første forsvarslinjen i hepatobiliærsystemet mot for eksempel luminale mikroorganismer¹⁰. Kolangiocyttenes forsvarseffekt mot toksiske overgrep kan svekkes av genetisk disposisjon. En giftig overbelastning forårsaker skade og ødeleggelse og kan derfor føre til kolangiopatier. Videre er den utviklende gallekanalen ikke helt i stand til alle selvbeskyttende mekanismer, noe som fører til høyere følsomhet for miljøgifter i neonatale gallekanaler¹¹.

Protocol

Etter etisk godkjenning (N045/2021) ble hann- og hunnmus C57BL/6-mus observert til de var 9 dager gamle. Dyrene ble født og gitt til eksperimentelle formål av dyreanlegget ved University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Tyskland. De nyfødte ble plassert i et bur sammen med sine foreldredyr. Miljøforholdene ble kontrollert i temperatur (20-24 ° C), 12:12 timers lys-mørk syklus og relativ fuktighet på 40% -70%. 1. Eksperimentell forberedelse Forbered d…

Representative Results

Figur 1A viser EBDS hos en murine nyfødt, som ble dissekert med den beskrevne teknikken. Mikroskopisk er ikke ytterligere levervev synlig. Levervevet er fjernet i løpet av de siste isolasjonstrinnene i protokollen og kan lett skilles fra gallegangsvev med hensyn til farge og konsistens. Figur 1B viser den isolerte prøven sammenlignet med en millimeterskala. EBDs lengde (målt fra galleblære til duodenal papilla) er mindre enn 10 mm. Diameteren på den meget …

Discussion

Denne artikkelen rapporterte og diskuterte opprettelsen og valideringen av en ny kirurgisk tilnærming for å fjerne EBDS av euthaniserte neonatale mus. Mikroskopiske og histologiske funn avslører at tilnærmingen raskt oppdager EBD og dissekerer dem nær kanalens marginer, selv hos nyfødte mus. Bare kirurgiske instrumenter og et mikroskop med 20x forstørrelse er nødvendig for den beskrevne protokollen. Videre tillater tilnærmingen isolering av hele EBDS. Teknikken er svært effektiv, grei og enkel å replikere.

…

Materials

2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides