Dissection des canaux biliaires extrahépatiques et de la vésicule biliaire chez les nouveau-nés de souris âgés de neuf jours

Résumé

Pour l’observation des troubles des voies biliaires néonatales murines, un canal biliaire intact et une préparation efficace sont nécessaires. Par conséquent, une nouvelle approche pour isoler l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques chez les nouveau-nés murins a été développée avec succès tout en maintenant l’intégrité des voies biliaires.

Résumé

La dissection des voies biliaires néonatales murines a été décrite comme difficile. L’objectif principal de la procédure opératoire standard décrite est l’isolement du canal biliaire extrahépatique (EBD) chez les nouveau-nés de souris sans endommager le canal biliaire pendant la préparation. En raison de sa préparation exceptionnellement étroite par rapport à la lignée cellulaire des cholangiocytes et de la récolte de l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques (EBDS), l’approche décrite est extrêmement utile dans la recherche de modèles animaux de troubles des voies biliaires chez le nouveau-né, tels que l’atrésie biliaire. Après l’euthanasie, la cavité péritonéale a été consultée et le système des voies biliaires, le duodénum et le foie ont été extraits avec la résection unique En-bloc (EbR). L’échantillon extrait est placé sur un tapis de mousse, et l’EBD est disséqué des cellules contaminantes de manière atraumatique sans contact nécessaire. La dissection de l’ensemble de l’EBDS est un avantage significatif de cette méthode. Des précautions doivent être prises en raison de la petite taille et de la petite quantité de tissu des canaux biliaires. En utilisant la technique décrite, il n’y a pas de dommages aux cholangiocytes. De plus, la pureté de la technique est reproductible (n = 10). Par conséquent, des échantillons comparables de manière optimale peuvent être récoltés. De plus, aucun tissu des canaux biliaires n’est endommagé, car tout contact avec le système des canaux biliaires peut être évité pendant la préparation, laissant le liquide biliaire à l’intérieur de la vésicule biliaire. Plus important encore, lors de la dissection finale de la vésicule biliaire et des voies biliaires, des microinstruments atraumatiques n’ont été utilisés que légèrement latéralement du canal biliaire sans le serrer. C’est la clé d’un échantillon propre et intact, et essentiel pour une investigation histologique plus approfondie ou l’isolement des cholangiocytes. En résumé, la technique de dissection innovante décrite permet aux opérateurs, en particulier inexpérimentés, disposant de l’équipement nécessaire, d’isoler le EBDS aussi proprement que possible.

Introduction

La genèse et la progression des cholangiopathies telles que l’atrésie biliaire, la cholangite sclérosante primitive (CSP) et la cholangite biliaire primitive (CBP) sont inconnues ou incomplètes ^1,2. La compréhension limitée de l’origine et de la progression de ces maladies conduit à une pénurie d’options thérapeutiques³. L’obstacle le plus difficile dans l’étude des troubles des voies biliaires néonatales est d’acquérir une compréhension moléculaire de la physiopathologie. L’une des clés essentielles d’une meilleure compréhension de la pathologie moléculaire est la meilleure observation....

Protocole

Suite à l’approbation éthique (N045/2021), des nouveau-nés de souris C57BL/6 mâles et femelles ont été observés jusqu’à l’âge de 9 jours. Les animaux sont nés et fournis à des fins expérimentales par l’animalerie du Centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf, Hambourg, Allemagne. Les nouveau-nés ont été logés dans une cage avec leurs animaux parents. Les conditions environnementales ont été contrôlées en température (20-24 °C), 12:12 h de cycle lumière-obscurité et humidité relative de 40 % à 70 %.

1. Préparation expérimentale

1. Préparez l’équipement requis pour l’opération chirurgicale, y compris les ciseau....

Résultats

La figure 1A montre l’EBDS d’un nouveau-né murin, qui a été disséqué avec la technique décrite. Au microscope, aucun autre tissu hépatique n’est visible. Le tissu hépatique a été enlevé au cours des dernières étapes d’isolement du protocole et pourrait facilement être distingué du tissu des canaux biliaires en ce qui concerne la couleur et la consistance. La figure 1B montre l’échantillon isolé par rapport à une échelle millimétrique. La longueur de l’EBD (mesur.......

Discussion

Cet article rapportait et discutait de la création et de la validation d’une nouvelle approche chirurgicale pour retirer l’EBDS de souris néonatales euthanasiées. Les résultats microscopiques et histologiques révèlent que l’approche détecte rapidement les EBD et les dissèque près des marges du canal, même chez les souris néonatales. Seuls des instruments chirurgicaux et un microscope avec un grossissement de 20x sont nécessaires pour le protocole décrit. De plus, l’approche permet d’isoler l’ensemble de l’EBDS. La techni.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	utilisé comme agent déshydratant
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula pour l’hydratation de l’échantillon
Air vent	C + P Mö ; belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Allemagne	Tec-Ononmic AZ 1200	l’utilisation d’une bouche d’aération permet d’éviter l’inhalation de fixateurs contenant du formol
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Allemagne	2351744	saline ; Récipient : Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, pince
microchirurgicale	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	droite, 180 mm (7"), pointe plate-forme, poignée ronde, largeur : 0,800 mm, recouverte de poussière de diamant, non stérile, outil réutilisable en option pour l’observation et toutes les étapes de la préparation, sauf la préparation très finale ; Division de la peau du péritoine
Caméra " SmartCAM 5 pouces   ;	Basler and Vision Engineering, Send, Royaume-Uni	EVC131A	en option Caméra Lynx Exo module : type de capteur : CMOS, résolution 2560 x 1920 pixels, taille du capteur : 1/2" ; Utilisé pour la production vidéo et l’évaluation technique
Machine de déshydratation/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Allemagne	12612613	utilisé pour la déshydratation automatique, programme court (env. 4,8 h)
Éponge de déshydratation  ;	Éponge Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	TT56.1	pour l’étape finale de dissection, d’autres éponges/tampons en mousse avec une taille de pores minimale de 60 pores par pouce conviennent également, l’utilisation de deux tampons en mousse par cassette d’enrobage est recommandée pour couvrir l’échantillon par le bas et par le haut afin d’éviter de glisser à travers la perforation des cassettes d’enrobage
Dulbecco´ ; s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Ne & aigu ; t contient du calzium ou du magnésium, 500 mL
Cassettes d’enrobage	Engelbrecht GmbH, Edermü ; nde, Allemagne	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Allemagne	41-6660-00	solution de coloration, prête à l’emploi
Ciseaux fins CeramaCut	FST, Heidelberg Allemagne	14959-09	Pointes : Sharp-Sharp, Alliage / Matériau : Acier inoxydable revêtu de céramique, dentelé :, Oui ; Caractéristique : CeramaCut, Forme de la pointe : Droit, Tranchant : 22 mm, Longueur : 9 cm ; Incision cutanée, incision de la fenêtre péritonéale
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Allemagne	11051-10	Longueur : 10 cm, Forme de l’embout : incurvée, dentelée, Largeur de l’embout : 0,8 mm, Dimensions de l’embout : 0,8 x 0,7 mm, Alliage / Matériau : Acier inoxydable
Hématoxyline	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Allemagne	41-5130-00	solution de coloration, prête à l’emploi
Microscope Highresolotion	Vision Engineering, Envoyer Royaume-Uni	EVO503° ;	Capable d’un grossissement jusqu’à 60x, seuls des grossissements de 6x à 20x ont été utilisés.
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hambourg, Allemagne	BX60F5
Vitres de couverture de microscope	Marienfeld, Lauda-Kö ; nigshofen, Allemagne	101244	60 mm de large, en verre SCHOTT D 263
Lames de microscope	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Allemagne	03-0060
Microtome	Leica, Nuß ; loch, Allemagne	SM2010R	Outil pour le sectionnement (2 & micro ; tranches M)  ;
Seringue Omnifix-F 1 mL	B Braun, Melsungen, Allemagne	9161406V	seringue sans canule
Paraffine	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffine Wax Tek III, sans DMSO
Machine d’enrobage de paraffine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Allemagne	TES 99	La machine d’enrobage utilisée dans cette étude contenait les trois modules individuels suivants : TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. L’échantillon doit être incorporé dans de la paraffine directement après la déshydratation, aucun stockage intermédiaire dans un réfrigérateur ne doit être effectué en raison d’un éventuel rétrécissement et de l’humidité dans le réfrigérateur
Paraformaldéhyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Préparez 1 mL d’aliquotes dans 2 mL Tubes coniques Eppendorf pour les échantillons de foie et 0,5 mL d’aliquotes dans 1 mL Tubes coniques Eppendorf pour échantillons de voies biliaires extrahépatiques, 4 % en PBS ph 7,4  ;
Petite pince microchirurgicale  ;	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü ; tthard, Bayern, Germany	(00)165	Manche rond, droit, pointe de 0,3 mm, outil pour l’observation et chaque étape de la préparation, particulièrement utile pour la préparation finale
Règle en acier inoxydable	Agntho’s AB, Lidingö ;, Sweden	30085-15	150mm avec métrique & Graduations en pouces
Ciseaux chirurgicaux &ndash ; Sharp-blunt pour la décapitation	FST, Heidelberg Allemagne	14001-14	Dispositif pour la décapitation
Armoire chauffante	Haraeus, Hanau, Allemagne	T 6060	les échantillons tranchés doivent être conservés dans l’armoire chauffante pour assurer la fixation de l’échantillon sur les lames de microscope

stérile