Dissecção do ducto biliar extra-hepático e da vesícula biliar em neonatos de camundongos com nove dias de idade

Summary

Para a observação de distúrbios do ducto biliar neonatal murino, um ducto biliar intacto e uma preparação eficiente são necessários. Portanto, uma nova abordagem para isolar todo o sistema do ducto biliar extra-hepático em neonatos murinos foi desenvolvida com sucesso, mantendo a integridade do ducto biliar.

Abstract

A dissecção dos ductos biliares neonatais murinos tem sido descrita como difícil. O principal objetivo do procedimento cirúrgico padrão descrito é o isolamento do ducto biliar extra-hepático (EBD) em neonatos de camundongos sem danificar o ducto biliar durante a preparação. Devido à sua preparação excepcionalmente próxima em comparação com a linhagem celular de colangiócitos e a colheita de todo o sistema de ducto biliar extra-hepático (EBDS), a abordagem descrita é extremamente útil na pesquisa de modelos animais de distúrbios do ducto biliar recém-nascido, como a atresia biliar. Após a eutanásia, a cavidade peritoneal foi acessada e o sistema de ductos biliares, duodeno e fígado foram extraídos com a única ressecção em bloco (EbR). A amostra extraída é colocada em um tapete de espuma, e a EBD é dissecada de células contaminantes atraumaticamente sem o toque necessário. A dissecação de toda a EBDS é uma vantagem significativa deste método. Deve-se ter cuidado devido ao pequeno tamanho e quantidade de tecido do ducto biliar. Usando a técnica descrita, não há danos aos colangiócitos. Além disso, a pureza da técnica é reprodutível (n = 10). Portanto, amostras comparáveis de forma ideal podem ser colhidas. Além disso, nenhum tecido do ducto biliar é prejudicado, porque qualquer contato com o sistema do ducto biliar pode ser evitado durante a preparação, deixando o fluido biliar dentro da vesícula biliar. Mais importante ainda, durante a realização da vesícula biliar final e da dissecção do ducto biliar, microinstrumentos atrauratos foram usados apenas ligeiramente laterais do ducto biliar sem apertá-lo. Esta é a chave para uma amostra limpa e intacta, e essencial para uma investigação histológica mais aprofundada ou o isolamento de colangiócitos. Para resumir, a técnica de dissecção inovadora descrita permite que operadores especialmente inexperientes com o equipamento necessário isolem a EBDS da forma mais limpa possível.

Introduction

A gênese e a progressão de colangiopatias como atresia biliar, colangite esclerosante primária (colangite esclerosante) e colangite biliar primária (CBP) são desconhecidas ou incompletas ^1,2. A compreensão limitada da origem e progressão dessas doenças leva a uma escassez de opções terapêuticas³. O obstáculo mais difícil no estudo dos distúrbios do ducto biliar neonatal é obter uma compreensão molecular da fisiopatologia. Uma das chaves essenciais para uma melhor compreensão da patologia molecular é a melhor observação possível do tecido afetado. Para evitar a redução da comparabilidade e discrepâncias entre as pesquisas, como a observação da potencial etiologia viral da atresia biliar⁴, surge a necessidade do melhor preparo possível e do compartilhamento das técnicas de dissecção realizadas. Uma preparação pura do tecido alvo é necessária para investigações microscópicas posteriores ou culturas organoides de células e 3D reprodutoras. No entanto, em distúrbios neonatais murinos, as amostras de tecido são raras e só ocorrem em pequena quantidade devido ao tamanho muito pequeno. Em relação aos distúrbios do ducto biliar, dificuldades no preparo limpo dos ductos biliares em neonatos murinos têm sido descritas⁵. Devido ao estágio neonatal de desenvolvimento, a diferenciação tecidual não é excessivamente avançada, o que complica o preparo e aumenta a dificuldade em comparação com o preparo de amostras adultas. Portanto, o grupo de trabalho operacional investigou uma nova estratégia para preparar a EBDS em um modelo de camundongo neonatal. No presente estudo, a técnica permite uma dissecção eficiente de cada amostra.

O sistema de ducto biliar é colocado intraperitonealmente no abdômen superior direito, surgindo do fígado. A vesícula biliar está localizada abaixo da superfície visceral do lobo direito do fígado. O ducto biliar, juntamente com a veia porta e a artéria hepática, está incorporado no ligamento hepatoduodenal. Ele une o fígado e o duodeno diretamente e drena o líquido biliar para o duodeno⁶. Anatomicamente, o ducto biliar é dividido nos ductos hepáticos direito e esquerdo, no ducto hepático comum, no ducto cístico e no ducto colédoco, que é formado pela confluência do ducto cístico e do ducto hepático comum⁷. Este eventualmente esvazia o líquido biliar e a saliva do ducto pancreático para o duodeno através da Ampola de Vater.

Os colangiócitos revestem o ducto biliar intra e extra-hepaticamente, habitando-se em um complicado nicho anatômico onde auxiliam na produção biliar e na homeostase⁸. O fluido biliar passa essas células epiteliais especializadas em altas concentrações diariamente. Em particular, a manutenção do guarda-chuva HCO3- é muito importante para a proteção contra a toxicidade dos ácidos biliares⁹. Os colangiócitos são a primeira linha de defesa no sistema hepatobiliar contra, por exemplo, microrganismos luminais¹⁰. A eficácia de defesa dos colangiócitos contra agressões tóxicas pode ser enfraquecida pela predisposição genética. Uma sobrecarga tóxica causa danos e destruição e, portanto, pode levar a colangiopatias. Além disso, o ducto biliar em desenvolvimento não é completamente capaz de todos os mecanismos de autoproteção, levando a uma maior suscetibilidade a toxinas ambientais nos ductos biliares neonatais¹¹.

Protocol

Após a aprovação ética (N045/2021), foram observados neonatos de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas até os 9 dias de idade. Os animais nasceram e foram fornecidos para fins experimentais pela instalação animal do Centro Médico Universitário de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha. Os neonatos foram alojados em uma gaiola junto com seus animais pais. As condições ambientais foram controladas em temperatura (20-24 °C), ciclo claro-escuro de 12:12 h e umidade relativa do ar de 40%-70%. <p class="jove_tit…

Representative Results

A Figura 1A mostra a EBDS de um neonato murino, que foi dissecado com a técnica descrita. Microscopicamente, nenhum outro tecido hepático é visível. O tecido hepático foi removido durante as etapas finais de isolamento do protocolo e pode ser facilmente distinguido do tecido do ducto biliar em relação à cor e consistência. A Figura 1B mostra a amostra isolada em comparação com uma escala milimétrica. O comprimento da EBD (medido da vesícula biliar ?…

Discussion

Este artigo relatou e discutiu a criação e validação de uma nova abordagem cirúrgica para a remoção da EBDS de camundongos neonatais eutanasiados. Os achados microscópicos e histológicos revelam que a abordagem detecta rapidamente as EBDs e as disseca perto das margens do ducto, mesmo em camundongos neonatais. Apenas instrumentos cirúrgicos e um microscópio com ampliação de 20x são necessários para o protocolo descrito. Além disso, a abordagem permite o isolamento de toda a EBDS. A técnica é altamente e…

Materials

2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides