Внепеченочный желчный проток и рассечение желчного пузыря у новорожденных девятидневных мышей
Summary
Для наблюдения за нарушениями желчных протоков новорожденных требуется интактный желчный проток и эффективная подготовка. Поэтому был успешно разработан новый подход к выделению всей внепеченочной системы желчных протоков у новорожденных мышей при сохранении целостности желчного протока.
Abstract
Рассечение мышиных неонатальных желчных протоков было описано как трудное. Основной целью описанной стандартной операционной процедуры является выделение внепеченочного желчного протока (EBD) у новорожденных мышей без повреждения желчного протока во время подготовки. Из-за его исключительно близкой подготовки по сравнению с клеточной линией холангиоцитов и сбором всей внепеченочной системы желчных протоков (EBDS), описанный подход чрезвычайно полезен при исследовании животных моделей нарушений желчных протоков новорожденных, таких как атрезия желчевыводящих путей. После эвтаназии была получена доступ к брюшной полости, а система желчных протоков, двенадцатиперстная кишка и печень были извлечены с помощью уникальной En-bloc-resection (EbR). Извлеченный образец помещают на пенопластовый мат, а EBD рассекают от загрязняющих клеток атравматично без необходимого прикосновения. Рассечение всей EBDS является существенным преимуществом этого метода. Следует соблюдать осторожность из-за небольшого размера и количества ткани желчных протоков. При использовании описанной методики не происходит повреждения холангиоцитов. Далее чистота методики воспроизводима (n = 10). Таким образом, можно собрать оптимально сопоставимые образцы. Кроме того, ткань желчных протоков не повреждается, потому что любого контакта с системой желчных протоков можно избежать во время приготовления, оставив желчную жидкость внутри желчного пузыря. Самое главное, что при выполнении заключительного рассечения желчного пузыря и желчных протоков атравматические микроинструменты использовались лишь незначительно латерально от желчного протока, не сдавливая его. Это ключ к чистому и неповрежденному образцу и необходим для дальнейшего гистологического исследования или выделения холангиоцитов. Подводя итог, можно сказать, что описанная инновационная методика вскрытия позволяет особенно неопытным операторам с необходимым оборудованием максимально четко изолировать EBDS.
Introduction
Генезис и прогрессирование холангиопатий, таких как билиарная атрезия, первичный склерозирующий холангит (PSC) и первичный билиарный холангит (PBC), либо неизвестны, либо неполны 1,2. Ограниченное понимание происхождения и прогрессирования этих заболеваний приводит к нехватке вариантов терапии3. Самым сложным препятствием в изучении неонатальных нарушений желчных протоков является получение молекулярного понимания патофизиологии. Одним из важных ключей к лучшему пониманию молекулярной патологии является наилучшее наблюдение за пораженной тканью. Чтобы избежать снижения сопоставимости и расхождений между исследованиями, таких как наблюдение за потенциальной вирусной этиологией атрезии желчевыводящихпутей 4, возникает необходимость в наилучшей возможной подготовке и совместном использовании выполненных методов диссекции. Чистая подготовка ткани-мишени необходима для последующих микроскопических исследований или разведения клеточных и 3D-органоидных культур. Однако при неонатальных заболеваниях мышей образцы тканей встречаются редко и встречаются только в небольшом количестве из-за очень маленького размера. Что касается нарушений желчных протоков, то описаны трудности в чистой подготовке желчных протоков у новорожденных мышей5. Из-за неонатальной стадии развития дифференцировка тканей не слишком развита, что затрудняет подготовку и увеличивает сложность по сравнению с подготовкой взрослых образцов. Поэтому операционная рабочая группа исследовала новую стратегию подготовки EBDS в модели неонатальной мыши. В настоящем исследовании этот метод позволяет эффективно распределять каждый образец.
Система желчных протоков внутрибрюшинно размещается в правой верхней части живота, возникая из печени. Желчный пузырь расположен под висцеральной поверхностью правой доли печени. Желчный проток вместе с воротной веной и печеночной артерией внедряется в гепатодуоденальную связку. Он соединяет печень и двенадцатиперстную кишку непосредственно и дренирует желчную жидкость в двенадцатиперстную кишку6. Анатомически желчный проток делится на правый и левый печеночный протоки, общий печеночный проток, кистозный проток и Ductus choledochus, который образуется слиянием кистозного протока и общего печеночного протока7. Этот в конечном итоге опорожняет желчную жидкость и слюну из протока поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку через ампулу Фатера.
Холангиоциты выстилают желчный проток внутри- и экстрагепатически, обитая в сложной анатомической нише, где они помогают в производстве желчи и гомеостазе8. Желчная жидкость ежедневно проходит через эти специализированные эпителиальные клетки в высоких концентрациях. В частности, поддержание зонтика HCO3 очень важно для защиты от токсичности желчных кислот9. Холангиоциты являются первой линией обороны в гепатобилиарной системе против, например, просветных микроорганизмов10. Защитная эффективность холангиоцитов от токсических атак может быть ослаблена генетической предрасположенностью. Токсическая перегрузка вызывает повреждение и разрушение и, следовательно, может привести к холангиопатии. Кроме того, развивающийся желчный проток не полностью способен ко всем самозащитным механизмам, что приводит к более высокой восприимчивости к токсинам окружающей среды в желчных протоках новорожденных11.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье сообщалось и обсуждалось создание и валидация нового хирургического подхода к удалению EBDS усыпленных неонатальных мышей. Микроскопические и гистологические данные показывают, что подход быстро обнаруживает ЭБД и рассекает их вблизи краев протока, даже у неонатальных мы…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность Йоханне Хагенс, Паулине Шупперт, Кларе Филиппи, доктору медицинских наук Кристиану Томушату, Свенье Варнке, доктору Диане Линднер, профессору доктору Дирку Вестерманну, Мириам Томчак, Николь Людер, Надин Курзаве, доктору рер нат. Лайе Пагеролс Ралуй, Биргит Аппль и Магдалене Трохимюк за их вклад. Ганс Христиан Шмидт получил финансовую поддержку от стипендии Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Гамбург.
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the ‘biliary HCO3- umbrella’: an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
