Extrahepatisk gallgång och gallblåsedissektion hos nio dagar gamla musnyfödda
Summary
För observation av murina neonatala gallgångsstörningar krävs en intakt gallgång och effektiv förberedelse. Därför utvecklades ett nytt tillvägagångssätt för att isolera hela det extrahepatiska gallkanalsystemet i murina nyfödda framgångsrikt samtidigt som gallgångens integritet bibehölls.
Abstract
Dissektion av murina neonatala gallgångar har beskrivits som svår. Huvudsyftet med det beskrivna standardoperationsförfarandet är isoleringen av den extrahepatiska gallgången (EBD) hos musnyfödda utan att skada gallgången under beredningen. På grund av dess exceptionellt nära förberedelse jämfört med kolangiocyternas cellinje och skörd av hela det extrahepatiska gallgångssystemet (EBDS) är det beskrivna tillvägagångssättet extremt användbart vid forskning av djurmodeller av nyfödda gallgångsstörningar, såsom gallatresi. Efter eutanasi nåddes bukhålan och gallgångssystemet, tolvfingertarmen och levern extraherades med den unika En-bloc-Resection (EbR). Det extraherade provet placeras på en skummatta och EBD dissekeras från förorenande celler atraumatiskt utan nödvändig beröring. Dissektion av hela EBDS är en betydande fördel med denna metod. Försiktighet måste vidtas på grund av den lilla storleken och mängden gallgångsvävnad. Med hjälp av den beskrivna tekniken finns det ingen skada på kolangiocyterna. Vidare är teknikens renhet reproducerbar (n = 10). Därför kan optimalt jämförbara prover skördas. Dessutom skadas ingen gallgångsvävnad, eftersom all kontakt med gallgångssystemet kan undvikas under beredningen och lämnar gallvätskan inuti gallblåsan. Viktigast av allt, medan man utförde den slutliga gallblåsan och gallgångsdissektionen, användes atraumatiska mikroinstrument endast något i sidled av gallgången utan att klämma på den. Detta är nyckeln till ett rent och intakt prov och viktigt för ytterligare histologisk undersökning eller isolering av kolangiocyter. Sammanfattningsvis gör den beskrivna innovativa dissektionstekniken det möjligt för särskilt oerfarna operatörer med nödvändig utrustning att isolera EBDS så rent som möjligt.
Introduction
Uppkomsten och utvecklingen av kolangiopatier såsom gallatresi, primär skleroserande kolangit (PSC) och primär gallkolangit (PBC) är antingen okända eller ofullständiga 1,2. Den begränsade förståelsen av ursprunget och utvecklingen av dessa sjukdomar leder till brist på behandlingsalternativ3. Det svåraste hindret för att studera neonatala gallgångsstörningar är att få en molekylär förståelse för patofysiologin. En av de viktigaste nycklarna till en bättre förståelse av molekylär patologi är bästa möjliga observation av drabbad vävnad. För att undvika minskad jämförbarhet och skillnader mellan forskning, såsom att observera potentiell viral etiologi av gallatresi4, uppstår behovet av bästa möjliga beredning och delning av de utförda dissektionsteknikerna. En ren beredning av målvävnaden är nödvändig för senare mikroskopiska undersökningar eller avel av cell- och 3D-organoidkulturer. Men vid murina neonatala störningar är vävnadsprover sällsynta och förekommer endast i en liten mängd på grund av den mycket lilla storleken. När det gäller gallgångsstörningar har svårigheter med en ren beredning av gallgångar hos murina nyfödda beskrivits5. På grund av det neonatala utvecklingsstadiet är vävnadsdifferentiering inte alltför avancerad, vilket komplicerar beredningen och ökar svårigheten jämfört med beredningen av vuxna prover. Därför undersökte den operativa arbetsgruppen en ny strategi för att förbereda EBDS i en neonatal musmodell. I den aktuella studien möjliggör tekniken en effektiv dissektion av varje prov.
Gallkanalsystemet är intraperitonealt placerat i höger övre buk, som härrör från levern. Gallblåsan ligger under den viscerala ytan av leverns högra lob. Gallgången, tillsammans med portalvenen och leverartären, är inbäddad i hepatoduodenalt ligament. Det förenar levern och tolvfingertarmen direkt och dränerar gallvätska i tolvfingertarmen6. Anatomiskt är gallgången uppdelad i höger och vänster leverkanal, den gemensamma leverkanalen, den cystiska kanalen och Ductus choledochus, som bildas av sammanflödet av den cystiska kanalen och den gemensamma leverkanalen7. Den här tömmer så småningom gallvätska och saliv från bukspottkörtelkanalen in i tolvfingertarmen via Ampulla of Vater.
Kolangiocyter kantar gallgången intra- och extrahepatiskt och bor i en komplicerad anatomisk nisch där de hjälper till med gallproduktion och homeostas8. Gallvätska passerar dessa specialiserade epitelceller i höga koncentrationer dagligen. I synnerhet är HCO3-paraplyunderhållet mycket viktigt för att skydda mot gallsyratoxicitet9. Kolangiocyter är den första försvarslinjen i hepatobiliärsystemet mot exempelvis luminala mikroorganismer10. Kolangiocyternas försvarseffekt mot giftiga angrepp kan försvagas av genetisk predisposition. En giftig överbelastning orsakar skador och förstörelse och kan därför leda till kolangiopatier. Dessutom är den utvecklande gallgången inte helt kapabel till alla självskyddande mekanismer, vilket leder till en högre känslighet för miljögifter i neonatala gallgångar11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna artikel rapporterade och diskuterade skapandet och valideringen av ett nytt kirurgiskt tillvägagångssätt för att ta bort EBDS av avlivade neonatala möss. Mikroskopiska och histologiska fynd avslöjar att tillvägagångssättet snabbt upptäcker EBD och dissekerar dem nära kanalens marginaler, även hos neonatala möss. Endast kirurgiska instrument och ett mikroskop med 20x förstoring krävs för det beskrivna protokollet. Dessutom möjliggör tillvägagångssättet isolering av hela EBDS. Tekniken är mycket…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl och Magdalena Trochimiuk för deras bidrag. Hans Christian Schmidt fick ekonomiskt stöd av Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME-stipendiet (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the ‘biliary HCO3- umbrella’: an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
