このプロトコルは、中処理から高スループットのオルガノイド薬物スクリーニングのための半自動化された方法と、顕微鏡に依存しない自動画像分析ソフトウェアを説明し、マルチパラメトリックの単一オルガノイド薬物反応を定量化および視覚化して、腫瘍内の不均一性をキャプチャします。
患者由来の腫瘍オルガノイド(PDTO)は、前臨床およびトランスレーショナル研究、および ex vivo 薬物スクリーニングからの患者の治療反応の予測に大きな期待を寄せています。ただし、現在のアデノシン三リン酸(ATP)ベースの薬物スクリーニングアッセイでは、バルク読み出しのためにPDTOに保持されることが示されている薬物反応(細胞増殖抑制または細胞毒性)および腫瘍内の不均一性の複雑さを捉えていません。生細胞イメージングは、この問題を克服し、薬物反応をより詳細に視覚化するための強力なツールです。ただし、画像解析ソフトウェアは、PDTOの3次元性に適合していないか、蛍光生存率色素を必要とするか、384ウェルマイクロプレートフォーマットと互換性がないことがよくあります。この論文では、従来の広視野生細胞イメージングシステムを使用して、ハイスループットの384ウェルフォーマットでPDTOをシード、処理、およびイメージングするための半自動化された方法論について説明します。さらに、生存率マーカーを使用しない画像解析ソフトウェアを開発し、再現性を向上させ、異なるPDTO株間の成長率の変動を修正する成長率ベースの薬物反応指標を定量化しました。陽性および陰性の対照条件に正規化された増殖速度に基づいて薬物応答をスコアリングする正規化薬物応答メトリックと蛍光細胞死色素を使用すると、細胞毒性および細胞増殖抑制薬物応答を簡単に区別でき、応答者と非応答者の分類を大幅に改善します。さらに、薬物応答の不均一性は、単一オルガノイド薬物応答分析から定量化することにより、潜在的な耐性クローンを特定することができます。最終的に、この方法は、速度論的成長停止および細胞死の定量化を含むマルチパラメトリック薬物応答シグネチャを捕捉することによって、臨床治療応答の予測を改善することを目的としている。
近年、 in vitro がんの創薬、薬物スクリーニング、および基礎研究は、不死化細胞株を備えた従来の2次元(2D)がんモデルの使用から、より生理学的に関連する3次元(3D)がんモデルへの移行が進んでいます。これにより、固形腫瘍に存在するより複雑な細胞間相互作用および構造を再現する、確立された癌細胞株を有する腫瘍スフェロイドの採用に拍車がかかる。現在、患者由来の腫瘍オルガノイド(PDTO)は、腫瘍スフェロイドよりも追加の利点、つまりがん患者に見られる不均一性を提供するため、 in vitro がん研究に利用できる最も先進的で生理学的に関連性のある3Dがんモデルです1。PDTOは、がん患者に由来する腫瘍組織から確立されるため、腫瘍表現型と遺伝子型の両方を保持します。このように、PDTOは基礎がんおよびトランスレーショナルがん研究にとって非常に貴重になりつつあり、精密腫瘍学を大幅に改善する可能性を秘めています2。
有望な可能性にもかかわらず、これらの洗練された3Din vitroがんモデルは、高度な分析方法がないため、十分に活用されていないことがよくあります。最も一般的に使用されるアッセイは、細胞内ATP3の定量を介してPDTO中の生存細胞の数を決定する。これらのアッセイは通常、単一時点のバルク分析であるため、重要な時間依存応答を見落とし、クローン応答を無視します。具体的には、PDTOの成長(成長率)および特定の治療法に対するそれらの反応を監視する能力は、非常に興味深い4,5。陽性(ctrl+)および陰性対照(ctrl-)状態に正規化された成長率に基づいて薬物反応をスコアリングする正規化薬物反応(NDR)も、主に2D細胞株に対して行われていましたが、細胞ベースのスクリーニングで抗がん剤感受性を評価するための重要な指標であることが最近報告されています6。したがって、これらのより臨床的に代表的で複雑な3Dがんモデルを十分に活用するには、より高度な分析方法が必要です。顕微鏡検査は、これらのオルガノイドモデルの複雑さを研究するための強力なアプローチと考えられています7。
この論文では、従来の広視野顕微鏡と生細胞イメージングシステムを使用して、3Dがんモデルにおけるキネティックドラッグ応答をモニタリングする方法について説明します。Driehuisら4によって記述されたプロトコルは、ピペッティングロボット、デジタル薬剤ディスペンサー、および生細胞イメージングシステムを使用した自動化と互換性があり、再現性を高め、「実践的」労働時間の数を減らすように適応されました。この方法では、384ウェルマイクロプレートおよびマルチオルガノイドフォーマットで、確立された癌細胞株(試験細胞株については補足表S1を参照)を有する腫瘍スフェロイドとPDTOの両方の中スループットからハイスループットの薬物スクリーニングが可能になります。畳み込みネットワーク機械学習プロセスを使用することにより、蛍光生細胞標識色素を使用せずに、明視野イメージングのみから個々の腫瘍スフェロイドまたはPDTOの自動同定と追跡を実行できます8。明視野イメージングによるほとんどの同定は、手動アノテーションを必要とする(これは面倒で時間がかかる)か、蛍光色素の添加を必要とし、光キシシティ誘発酸化ストレスに関連する薬物応答を混乱させる可能性があるため、これは非常に有利です9。
自社で開発された画像解析ソフトウェアは、3D画像解析モジュールが利用できないか、プラットフォームが制限されているか、384ウェルマイクロプレートおよびホールウェルイメージングと互換性がないため、従来の生細胞イメージングシステムの機能を拡張します。さらに、これらのモジュールは多くの場合、高価格であり、バルクオルガノイドの読み出しが制限されています。したがって、この方法は、広く利用可能な生細胞イメージングシステムにアクセスでき、ゴールドスタンダードであるが初歩的なATPベースのアッセイと比較して、薬物反応に関するより多くの情報を抽出することを目指す科学者にとって非常に関連性があります。特定の細胞死指標を追加することで、細胞増殖抑制薬物応答を細胞傷害反応と区別することができ、単一時点解析では現在達成できない機構的な薬物作用に関するさらなる洞察を提供します。最後に、生細胞イメージングにより、個々のオルガノイド追跡により、単一のオルガノイド薬物応答メトリックを取得し、応答の不均一性をキャプチャし、潜在的な耐性サブクローンを特定できます。
この方法および関連する画像解析ソフトウェアの目標は、オルガノイド薬物スクリーニングにおいて低コストの自動化を実装して、ユーザーの介入を制限し、取り扱い、画像解析、およびデータ解析におけるばらつきを低減することである。このソフトウェアを研究者が利用できるようにするために、顕微鏡やプラットフォームに依存せず、クラウドベースのアプリケーションが利用可能になります。そのため、従来の生細胞イメージングシステムをサポートすることで、3D培養アプリケーションや解析への機能向上も目指しています。
中スループットからハイスループットのPDTO薬物スクリーニングは、オルガノイドが潜在的に提供できる情報のほんの一部しか抽出しない読み出しに依存することがよくあります。急速に進化するオルガノイド技術がより大きな科学的および臨床的可能性を実現するためには、より高度な3Dアッセイ、読み出し、および分析方法が不可欠であることがますます明らかになっています。ここでは、再現性を高めるだけでなく、AI駆動の生細胞イメージング読み出しを組み込むことで臨床翻訳可能性を大幅に向上させる高度なスクリーニングパイプラインについて説明します。社内で開発された分析ソフトウェアに加えて、正規化された薬物反応指標(NDR)の使用が実装されており、治療反応における患者固有の違いを定義する能力を明確に示しています6。
この正規化指標を含めることは間違いなく非常に価値があり、多くの研究が曲線下面積(AUC)または半最大阻害濃度(IC50)のわずかな違いに基づいて治療反応を描写することを目的としていることを思い出してください(ほとんどの用量反応曲線は互いに重なり合っている/近くに位置しているため)11,12。.成長率の指標は、ATPベースのアッセイを用いたオルガノイド薬物スクリーニングプロトコルですでに実装されていますが、時点0から4で溶解された参照ウェルの正規化に依存しています。対照的に、この方法では、PDTO成長率の患者間差だけでなく、播種密度の変動とプレート位置依存効果に起因するウェル間差も考慮して再現性を高めるウェル内成長率の正規化が可能になります。さらに、正常化のためのポジティブコントロールを含めることにより、患者間PDTO応答の分離をさらに高めるようにNDRを適応させました6,8。
さらに、ハイスループットおよび自動化フォーマットと互換性のあるこの分析は、個々のオルガノイド応答を正確に検出できるため、腫瘍の再発と進行の主要な原動力であるサブクローナル耐性の定量が可能になります13。例えば、PDAC052およびPDAC060は in vitro での治療に対して良好な反応を示したが(NDRに基づく)、追加の単一オルガノイド分析では、治療に反応しないサブクローンの小さな(より大きな集団)集団を検出することができた。興味深いことに、PDAC052とPDAC060は持続的な反応(腫瘍活動は検出されなかった)を示したが、最終的には両方とも局所腫瘍進行と診断された(耐性クローンの存在による)ことを考えると、これは臨床観察と非常に一致した。従来の3D読み出し(ATPベースのアッセイとサイズ/数)と比較して、この高度なスクリーニングパイプラインは、これらの「ラボ内の患者」からより臨床的に関連する情報を抽出することにより、予測パフォーマンスを向上させることが期待されます。この仮説は現在、著者の研究室で臨床PDTOサンプルをスクリーニングすることによってテストされています この方法を使用して、 ex vivoを in vivo 応答および臨床転帰と相関させます。
薬物応答のメカニズムに関するより多くの洞察を得るために、細胞毒性色素に加えて、従来の蛍光生細胞イメージング試薬がこの方法に適合し、細胞死のメカニズムを研究します。シスプラチン処理後のカスパーゼ依存的なアポトーシス誘導を研究するために、この方法とザルトリウスカスパーゼ3/7グリーン試薬との適合性を以前に示しました8。酸化ストレス(CellROX試薬)または低酸素症(Image-iT低酸素試薬)を研究するための他の色素との適合性は、まだテストされていません。しかしながら、これらの試薬は、すでに3D インビトロ モデル14、15において首尾よく使用されている。
画像解析ソフトウェアは、オルガノイドの鮮明で焦点の合った画像をキャプチャできる場合、他のプレートフォーマットまたは培養方法(マイクロキャビティプレート、ECMドームなど)とも互換性があります。ドームで培養されたオルガノイドは異なるz面で成長するため、これはしばしば困難であり、常に利用できるとは限らない顕微鏡のzスタッキング機能が必要です。したがって、十分な品質の画像を確保するために、平底ULA 384ウェルマイクロプレートの使用をお勧めします。
さらに、この分析は、IncuCyte ZOOMシステム8でキャプチャされた位相差画像について前に示したように、他の生細胞イメージングシステムと互換性があります。この原稿で使用されたSpark Cyto生細胞イメージングシステムの制限は、速度論的測定のためのワンプレート容量です。ただし、Spark Motion拡張により、容量は最大40枚のマイクロプレートに増加し、まとめてスクリーニングできます。自社開発のソフトウェアの互換性をこれらのシステムや他のシステムに拡張し、プラットフォームに依存しないソリューションを提供し、画像およびデータ分析パイプラインの標準化と自動化を目標としています。Webベースのアプリケーションには、このホワイトペーパーに示すように、インタラクティブなグラフ作成ツールと自動化された薬物測定計算も含まれ、手動分析時間を短縮します。
ラベルフリーのPDTOセグメンテーションアルゴリズムは、明確な形態学的違い(固体、半固体、嚢胞性)を持つさまざまな社内成長回転楕円体およびPDTOモデルでトレーニングおよびテストされており、その結果、これらを高精度で検出できます8。このモデルの限界は、嚢胞性PDTOを含めると、播種後のウェルに存在する気泡の望ましくない検出が増加したことです。しかし、一晩のインキュベーションは、これらの気泡のほとんどを除去するのに十分であり、定性的なタイムポイント0スキャンを可能にした。オルガノイド画像のセグメンテーションと方法の精度は、他のユーザーによって検証される必要があり、そのフィードバックに基づいて、ソフトウェアをさらにトレーニングして、堅牢で自動化された画像分析アルゴリズムを取得できます。さらに、この方法で定量化された 生体外 薬物反応を患者の臨床反応と相関させるためのより多くの臨床データを取得し、治療反応を予測するための最良のパラメーターを特定し、機能的精密癌医学のためにこの方法をさらに開発することを目指しています16。
The authors have nothing to disclose.
この研究の一部は、Dedert Schilde vzwやWilly Floren氏を含むさまざまなドナーからの寄付によって資金提供されました。この研究の一部は、フランダース研究財団、12S9221N(A.L.)、G044420N(S.V.、A.L.、E.G.)、1S27021N(M.L.)、およびアントワープ大学の産業研究基金、PS ID 45151(S.V.、A.L.、C.D.)によって資金提供されています。 図 1 は BioRender.com で作成されました。
6-well plate | Greiner | 657160 | |
8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
300 µL Tips | Opentrons | ||
384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
T8 plus cassette | Tecan | ||
TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |