En optimeret protokol præsenteres, der muliggør udtømning af cytoplasmatiske mikrotubulusorganiseringscentre i museoocytter under metafase I ved hjælp af en nær-infrarød femtosekundlaser.
Troskaben af oocytmeiose er afgørende for at generere udviklingsmæssigt kompetente euploide æg. Hos pattedyr gennemgår oocyten en langvarig anholdelse ved profase I af den første meiotiske division. Efter puberteten og ved meiotisk genoptagelse adskilles kernemembranen (nuklear kuvertnedbrydning), og spindlen samles hovedsageligt i oocytcentret. Indledende central spindelpositionering er afgørende for at beskytte mod unormale kinetochore-mikrotubuli (MT) vedhæftede filer og aneuploidi. Den centralt placerede spindel vandrer på en tidsfølsom måde mod cortex, og dette er en nødvendig proces for at ekstrudere en lille polær krop. I mitotiske celler er spindelpositionering afhængig af interaktionen mellem centrosommedierede astrale MT’er og cellebarken. Tværtimod mangler museoocytter klassiske centrosomer og indeholder i stedet adskillige acentriolære MT-organiseringscentre (MTOC’er). På metafase I-stadiet har museoocytter to forskellige sæt MTOC’er: (1) MTOC’er, der er grupperet og sorteret for at samle spindelpoler (polære MTOC’er), og (2) metafase cytoplasmatiske MTOC’er (mcMTOC’er), der forbliver i cytoplasmaet og ikke bidrager direkte til spindeldannelse, men spiller en afgørende rolle i reguleringen af spindelpositionering og rettidig spindelmigration. Her beskrives en multifoton laserablationsmetode til selektivt at nedbryde endogent mærkede mcMTOC’er i oocytter indsamlet fra Cep192-eGfp-reportermus . Denne metode bidrager til forståelsen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for spindelpositionering og migration i pattedyrs oocytter.
Haploide kønsceller (sæd og oocyt) produceres gennem meiose, hvilket indebærer en runde DNA-replikation efterfulgt af to på hinanden følgende divisioner, der er nødvendige for reduktion af kromosomtal inden befrugtning. Hos pattedyr, i det tidlige fosterliv, gennemgår oocyten en langvarig anholdelse (indtil puberteten) på diplotenstadiet af profase I i den første meiotiske division, et stadium kaldet germinal vesikel (GV) -stadiet. Efter meiotisk genoptagelse gennemgår GV-oocytten nuklear kuvertnedbrydning (NEBD), og spindlen samles hovedsageligt ved oocytcentret 1,2,3. Senere, drevet af F-actin, migrerer spindlen rettidigt fra oocytcentret til cortex for at sikre meget asymmetrisk opdeling, hvilket resulterer i et æg med et lille polært legeme (PB)4,5,6.
I mitotiske celler består centrosomerne af et par centrioler omgivet af pericentriolære materialekomponenter (PMC), såsom pericentrin, γ-tubulin, Cep152 og Cep1927. Disse centrioleholdige centrosomer bidrager til troskaben af bipolar spindeldannelse8. Imidlertid går centrioler tabt under tidlig oogenese i forskellige arter, herunder gnavere9. Derfor vedtager museoocytter en centrioleuafhængig spindelsamlingsvej ved hjælp af adskillige acentriolære mikrotubulus (MT) organiseringscentre (MTOC’er)9,10. Ved meiotisk genoptagelse gennemgår de perinukleære MTOC’er tre forskellige trin med genkondensering, strækning og fragmentering i et stort antal mindre MTOC’er11,12. De fragmenterede MTOC’er grupperes derefter og sorteres for at organisere en bipolar spindel10,13,14. En anden pool af MTOC’er er placeret i cytoplasmaet under NEBD. Nogle af disse cytoplasmatiske MTOC’er migrerer og danner spindelstænger (polære MTOC’er, pMTOC’er)10,11. For nylig blev en anden delmængde af cytoplasmatiske MTOC’er opdaget, kaldet metafase cytoplasmatiske MTOC’er (mcMTOC’er), der ikke bidrager til spindelpoldannelse, men forbliver i oocytcytoplasmaet under metafase I (Met I)15. Udtømning af mcMTOC’er ved multifotonlaserablation eller unormalt forøgelse af deres antal ved autofagihæmning forstyrrer spindelpositionering og migration og øger forekomsten af aneuploidi i metafase II oocytter15.
Interessant nok adskiller mcMTOC’er sig fra pMTOC’er i mange aspekter15. For eksempel, i modsætning til pMTOC’er, der hovedsageligt stammer fra perinukleære MTOC’er, stammer mcMTOC’er fra oocytbarken. Når spindlen stadig er i oocytcentret, lokaliseres mcMTOC’erne asymmetrisk modsat den side, som spindlen migrerer til for PB-ekstrudering15. Astrale mt’er kan ikke nå cortex i den relativt store oocytcelle. Derfor nukleerer disse mcMTOC’er MT’er for at forankre spindlen (via astrale lignende MTOC’er) til cortex. Disse resultater tyder på en model, hvor den mcMTOC-nukleerede MT-kraft modvirker den F-actin-medierede kraft, der driver spindelmigration mod cortex. Balancen mellem disse to modsatrettede kræfter er afgørende for at regulere den centrale spindelpositionering og rettidig spindelmigration15.
Til dato lokaliserer alle de undersøgte PMC-proteiner (pericentrin, g-tubulin, Cep192 og Aurora kinase A) til begge MTOC-puljer: mcMTOC’er og pMTOC’er15. Derfor er der ingen kemisk eller genetisk tilgang til selektivt at forstyrre mcMTOC’er uden forstyrrende pMTOC’er. Disse begrænsninger kan omgås ved selektivt at målrette mcMTOC’erne med laserablation. Blandt de laserbaserede teknologier, der er udviklet til mikroablation, viser pulserende multifoton femtosekundlasere stort potentiale på grund af deres præcisionspåvirkning begrænset til brændplanet, den høje penetrationsdybde af nær-infrarødt lys og den reducerede fototoksicitet og termiske skade på cellen16,17,18. Dette arbejde beskriver en selektiv tilgang til at ablate mcMTOC’er i museoocytter ved hjælp af en multifotonlaser koblet til et omvendt mikroskop.
Der findes forskellige metoder til at forstyrre de cytoskeletrelaterede strukturer i celler22,23,24,25. Det er imidlertid udfordrende at finde effektive teknikker til selektivt at forstyrre den målrettede struktur uden at gå på kompromis med cellens levedygtighed. Multifoton laserablationsmetoden, der præsenteres her, er en effektiv strategi til at inducere en selektiv mekanisk forstyrrelse til mcMTOC’er i oocyten uden at ændre oocytens levedygtighed.
Laserablation er blevet brugt i vid udstrækning til at forstå de molekylære mekanismer, der styrer kromosomadskillelse under mitose og meiose22,23,26,27. På grund af den relativt store størrelse (>80 mm i diameter) af pattedyrs oocytter sammenlignet med somatiske celler28 udgør ablationen af deres intracellulære strukturer en udfordring. Desuden er det gennemsnitlige mcMTOC-volumen i metafase I-oocytter ~ 20 μm15, hvilket repræsenterer en yderligere udfordring. En effektiv metode, der giver dybere vævsindtrængning, skal vedtages for at overvinde disse udfordringer. Den største fordel ved at bruge multifotonlaseren til ablation er dens evne til at nå dybere ind i cellen og samtidig minimere off-target-effekter29.
For at verificere laserablationsmetodens effektivitet og effektivitet til at nedbryde den målrettede struktur anbefales det at anvende et fluorescerende mærket protein til at identificere den målrettede struktur over tid (før og efter ablation)23. Det er vigtigt at bemærke, at laserablation udtømmer hele mcMTOC som struktur, og selvom mindre mcMTOC’er kun kræver en enkelt lasereksponering for at blive udtømt, kan større mcMTOC’er kræve mere end en lasereksponering ved forskellige fokusplaner. Det anbefales også at fiksere og immunmærke en delmængde af kontrol og mcMTOC-ablated oocytter med en MTOC-markør (såsom γ-tubulin, pericentrin eller Cep192) for at bekræfte effektiviteten af mcMTOC-ablationen yderligere. I kontroloocytter vil områder af cytoplasmaet lige ved siden af, men ikke overlappende med mcMTOC’er, blive udsat for laseren.
Dette eksperiment kræver flere mcMTOC-ablationer, mens de bevæger sig mellem forskellige fokalplaner i oocytterne. Derfor anbefales det stærkt at øve denne teknik flere gange, før eksperimentet udføres for at minimere eksperimenttiden og derved øge oocytlevedygtigheden. Desuden er det vigtigt at bruge den minimale lasereffekt, der er tilstrækkelig til at nedbryde mcMTOC’erne uden at påvirke oocytlevedygtigheden.
Denne teknik har nogle begrænsninger. For det første er multifoton konfokale mikroskoper relativt dyrere end almindelige konfokale mikroskoper. For det andet er det mere tidskrævende at forstyrre alle mcMTOC’er på forskellige fokusplaner end kemiske eller genetiske forstyrrelser. For det tredje kræver denne protokol tekniske færdigheder til at ablate alle mcMTOC’er på kortest mulig tid. Men når den først er mestret, giver brugen af multifotonlaseren en fremragende strategi til at forstyrre flere intracellulære strukturer i museoocytter, herunder mcMTOC’er, hvilket bidrager til forståelsen af molekylære mekanismer, der regulerer spindelpositionering og dens rettidige migration i pattedyrs oocytter.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af Balboula-laboratoriet for deres værdifulde hjælp og diskussioner. Forfatterne takker Melina Schuh for venligt at dele mCherry-Cep192-konstruktionen. Denne undersøgelse blev støttet af R35GM142537 (NIGMS, NIH) til AZB.
4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
Medium Essential Medium Eagle – MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 – 1L | |
Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |