Ce protocole décrit des méthodologies pour établir des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris pour l’expression génique et les analyses histologiques.
Le tissu endométrial tapisse la cavité interne de l’utérus et est sous le contrôle cyclique de l’œstrogène et de la progestérone. C’est un tissu composé d’épithélium luminal et glandulaire, d’un compartiment stromal, d’un réseau vasculaire et d’une population complexe de cellules immunitaires. Les modèles murins ont été un outil puissant pour étudier l’endomètre, révélant des mécanismes critiques qui contrôlent l’implantation, la placentation et le cancer. Le développement récent de cultures organoïdes endométriales 3D présente un modèle de pointe pour disséquer les voies de signalisation qui sous-tendent la biologie de l’endomètre. L’établissement d’organoïdes endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés, l’analyse de leurs transcriptomes et la visualisation de leur morphologie à une résolution unicellulaire sont des outils cruciaux pour l’étude des maladies de l’endomètre. Cet article décrit les méthodes permettant d’établir des cultures 3D d’épithélium endométrial à partir de souris et décrit des techniques pour quantifier l’expression des gènes et analyser l’histologie des organoïdes. L’objectif est de fournir une ressource qui peut être utilisée pour établir, cultiver et étudier l’expression génique et les caractéristiques morphologiques des organoïdes épithéliaux de l’endomètre.
L’endomètre – le tissu muqueux interne de la muqueuse de la cavité utérine – est un tissu unique et très dynamique qui joue un rôle essentiel dans la santé reproductive d’une femme. Au cours de la vie reproductive, l’endomètre a le potentiel de subir des centaines de cycles de prolifération, de différenciation et de dégradation, coordonnés par l’action concertée des hormones ovariennes – œstrogènes et progestérone. Des études sur des souris génétiquement modifiées ont révélé des mécanismes biologiques de base qui sous-tendent la réponse endométriale aux hormones et le contrôle de l’implantation des embryons, de la décidualisation des cellules stromales et de la grossesse1. Les études in vitro, cependant, ont été limitées en raison des difficultés à maintenir les tissus primaires de l’endomètre de souris non transformés dans les cultures cellulaires 2D traditionnelles 2,3. Les progrès récents dans la culture de tissus endométriaux en tant que systèmes d’organes 3D, ou organoïdes, présentent une nouvelle opportunité d’étudier les voies biologiques qui contrôlent la régénération et la différenciation des cellules endométriales. Des systèmes organoïdes de l’endomètre de souris et d’homme ont été développés à partir d’épithélium endométrial pur encapsulé dans diverses matrices4,5, tandis que l’endomètre humain a été cultivé sous forme de co-cultures épithéliales/stromales sans échafaudage6,7, et plus récemment sous forme d’assemblages épithéliaux/stromaux encapsulés dans du collagène8 . Le potentiel de croissance et de régénération des cultures organoïdes épithéliales est soutenu par un cocktail défini de facteurs de croissance et d’inhibiteurs de petites molécules qui ont été déterminés empiriquement pour maximiser la croissance et la régénération des organoïdes 4,5,9. De plus, la capacité de congeler et de décongeler les organoïdes de l’endomètre permet la mise en banque à long terme d’organoïdes endométriaux provenant de souris et d’humains pour des études futures.
Des souris génétiquement modifiées ont révélé les voies de signalisation complexes qui contrôlent la grossesse précoce et la décidualisation, et ont été utilisées comme modèles de perte de grossesse, de cancer de l’endomètre et d’endométriose. Ces études génétiques ont été réalisées en grande partie avec la délétion spécifique à la cellule des allèles flanqués de loxP (« floxed ») en utilisant des recombinases cre qui sont spécifiquement actives dans les tissus reproducteurs femelles. Ces modèles murins comprennent le récepteur de progestérone-cre 10 largement utilisé, qui a une forte activité de recombinase dans les tissus épithéliaux et stromaux de l’endomètre, la lactoferrine i-cre, qui induit la recombinaison épithéliale de l’endomètre chez les souris adultes11, ou Wnt7a-cre, qui déclenche une délétion épithéliale spécifique dans les tissus dérivés de Müller12 . La culture de tissus endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés en tant qu’organoïdes 3D a fourni une excellente occasion d’étudier la biologie de l’endomètre et de faciliter l’identification des facteurs de croissance et des voies de signalisation qui contrôlent le renouvellement et la différenciation des cellules endométriales13,14. Les méthodes d’isolement et de culture du tissu endométrial de souris sont décrites dans la littérature et rapportent l’utilisation de diverses stratégies enzymatiques pour l’isolement de l’épithélium utérin pour la culture ultérieure d’organoïdes épithéliaux de l’endomètre4. Alors que la littérature précédente fournit un cadre critique pour les protocoles de culture organoïde épithéliale de l’endomètre 4,5,6, cet article fournit une méthode claire et complète pour générer, maintenir, traiter et analyser ces organoïdes. La normalisation de ces techniques est importante pour accélérer les progrès dans le domaine de la biologie de la reproduction des femmes. Ici, nous rapportons une méthodologie détaillée pour la purification enzymatique et mécanique du tissu épithélial de l’endomètre de souris pour la culture ultérieure d’organoïdes de l’endomètre dans un échafaudage à matrice de gel. Nous décrivons également les méthodologies pour les analyses histologiques et moléculaires en aval des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris encapsulés dans la matrice de gel.
Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de l’endomètre de souris et les protocoles couramment utilisés pour leur analyse en aval. Les organoïdes de l’endomètre sont un outil puissant pour étudier les mécanismes qui contrôlent les maladies liées à l’endomètre, telles que l’endométriose, le cancer de l’endomètre et l’échec de l’implantation. Des études marquantes publiées en 2017 ont rapporté les conditions de culture à long terme et r…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions la Dre Stephanie Pangas et le Dr Martin M. Matzuk (M.M.M.) pour la lecture critique et la révision de notre manuscrit. Les études ont été soutenues par les subventions R00-HD00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) et R01-HD110038 (M.M.M.), et par la subvention de soutien du centre de cancérologie NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. est titulaire d’un prix Next Gen Pregnancy du Burroughs Wellcome Fund.
Organoid Media Formulation | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
Other supplies and reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |