Este protocolo descreve metodologias para estabelecer organoides epiteliais endometriais de camundongos para expressão gênica e análises histológicas.
O tecido endometrial reveste a cavidade interna do útero e está sob o controle cíclico do estrogênio e da progesterona. É um tecido composto por epitélio luminal e glandular, um compartimento estromal, uma rede vascular e uma população complexa de células imunes. Modelos de camundongos têm sido uma ferramenta poderosa para estudar o endométrio, revelando mecanismos críticos que controlam a implantação, a placentação e o câncer. O recente desenvolvimento de culturas organoides endometriais 3D apresenta um modelo de última geração para dissecar as vias de sinalização subjacentes à biologia endometrial. Estabelecer organoides endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados, analisar seus transcriptomas e visualizar sua morfologia em uma resolução de célula única são ferramentas cruciais para o estudo de doenças endometriais. Este artigo descreve métodos para estabelecer culturas 3D de epitélio endometrial de camundongos e descreve técnicas para quantificar a expressão gênica e analisar a histologia dos organoides. O objetivo é fornecer um recurso que possa ser usado para estabelecer, cultivar e estudar a expressão gênica e as características morfológicas dos organoides epiteliais endometriais.
O endométrio – o tecido mucoso do revestimento interno da cavidade uterina – é um tecido único e altamente dinâmico que desempenha papéis críticos na saúde reprodutiva de uma mulher. Durante a vida reprodutiva, o endométrio tem o potencial de sofrer centenas de ciclos de proliferação, diferenciação e quebra, coordenados pela ação concertada dos hormônios ovarianos – estrogênio e progesterona. Estudos de camundongos geneticamente modificados descobriram mecanismos biológicos básicos que sustentam a resposta endometrial aos hormônios e o controle da implantação embrionária, a decidualização das células estromais e a gravidez1. Estudos in vitro, no entanto, têm sido limitados devido a dificuldades na manutenção de tecidos endometriais primários de camundongos não transformados em culturas tradicionais de células 2D 2,3. Avanços recentes na cultura de tecidos endometriais como sistemas de órgãos 3D, ou organoides, apresentam uma nova oportunidade para investigar vias biológicas que controlam a regeneração e diferenciação de células endometriais. Sistemas organoides endometriais de camundongos e humanos têm sido desenvolvidos a partir de epitélio endometrial puro encapsulado em várias matrizes4,5, enquanto o endométrio humano tem sido cultivado como coculturas epiteliais/estromais livres de andaimes 6,7 e, mais recentemente, como assembloides epiteliais/estromais encapsulados em colágeno8 . O crescimento e o potencial regenerativo das culturas organoides epiteliais são apoiados por um coquetel definido de fatores de crescimento e inibidores de pequenas moléculas que foram determinados empiricamente para maximizar o crescimento e a regeneração dos organoides 4,5,9. Além disso, a capacidade de congelar e descongelar organoides endometriais permite o banco a longo prazo de organoides endometriais de camundongos e humanos para estudos futuros.
Camundongos geneticamente modificados revelaram as complexas vias de sinalização que controlam a gravidez precoce e a decidualização, e têm sido usados como modelos de perda de gravidez, câncer de endométrio e endometriose. Esses estudos genéticos foram amplamente alcançados com a deleção específica de células de alelos ladeados por loxP (“floxed”) usando cre recombinases que são especificamente ativas em tecidos reprodutivos femininos. Esses modelos de camundongos incluem o amplamente utilizado receptor de progesterona-cre 10, que tem forte atividade de recombinase nos tecidos epiteliais e estromais endometriais, a lactoferrina i-cre, que induz a recombinação epitelial endometrial em camundongos adultos11, ou Wnt7a-cre, que desencadeia deleção epitelial-específica em tecidos derivados de Müller12 . A cultura de tecidos endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados como organoides 3D tem proporcionado uma excelente oportunidade para investigar a biologia endometrial e facilitar a identificação de fatores de crescimento e vias de sinalização que controlam a renovação e diferenciação celular endometrial13,14. Métodos para o isolamento e cultura de tecido endometrial de camundongos são descritos na literatura e relatam o uso de várias estratégias enzimáticas para o isolamento do epitélio uterino para posterior cultura de organoides epiteliais endometriais4. Embora a literatura anterior forneça uma estrutura crítica para protocolos de cultura de organoides epiteliais endometriais 4,5,6, este artigo fornece um método claro e abrangente para gerar, manter, processar e analisar esses organoides. A padronização dessas técnicas é importante para acelerar os avanços no campo da biologia reprodutiva das mulheres. Aqui, relatamos uma metodologia detalhada para a purificação enzimática e mecânica do tecido epitelial endometrial de camundongos para a subsequente cultura de organoides endometriais em um andaime de matriz de gel. Também descrevemos as metodologias para análises histológicas e moleculares a jusante dos organoides epiteliais endometriais de camundongos encapsulados em matriz de gel.
Aqui, descrevemos métodos para gerar organoides epiteliais endometriais a partir do endométrio de camundongos e os protocolos rotineiramente utilizados para sua análise a jusante. Os organoides endometriais são uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos que controlam doenças relacionadas ao endométrio, como endometriose, câncer de endométrio e falha de implantação. Estudos de referência publicados em 2017 relataram as condições para a cultura de culturas de longo prazo e renováveis de organoides end…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos à Dra. Stephanie Pangas e ao Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) pela leitura crítica e edição do nosso manuscrito. Os estudos foram apoiados pelas bolsas R00-HD00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) e R01-HD110038 (M.M.M.), e pelo NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. possui um Prêmio de Gravidez de Próxima Geração do Burroughs Wellcome Fund.
Organoid Media Formulation | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
Other supplies and reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |