JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Etablera 3D-endometrieorganoider från musens livmoder

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64448
, , , , ,
1Department of Pathology & Immunology,Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery,Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine,Baylor College of Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver metoder för att etablera epitelorganiska epiteloider för mus för genuttryck och histologiska analyser.

Abstract

Endometrial vävnad leder livmoderns inre hålighet och är under cyklisk kontroll av östrogen och progesteron. Det är en vävnad som består av luminalt och körtelepitel, ett stromalfack, ett vaskulärt nätverk och en komplex immuncellpopulation. Musmodeller har varit ett kraftfullt verktyg för att studera endometrium och avslöjar kritiska mekanismer som styr implantation, placentation och cancer. Den senaste utvecklingen av 3D-endometriella organoidkulturer presenterar en toppmodern modell för att dissekera signalvägarna som ligger till grund för endometriebiologi. Att etablera endometrieorganoider från genetiskt modifierade musmodeller, analysera deras transkriptom och visualisera deras morfologi vid en encellsupplösning är avgörande verktyg för studier av endometriesjukdomar. Denna uppsats beskriver metoder för att etablera 3D-kulturer av endometrieepitel från möss och beskriver tekniker för att kvantifiera genuttryck och analysera organoidernas histologi. Målet är att tillhandahålla en resurs som kan användas för att etablera, odla och studera genuttryck och morfologiska egenskaper hos endometrieepitelorganoider.

Introduction

Endometrium – livmoderhålans inre slemhinnevävnad – är en unik och mycket dynamisk vävnad som spelar kritiska roller i en kvinnas reproduktiva hälsa. Under den reproduktiva livslängden har endometrium potential att genomgå hundratals cykler av spridning, differentiering och nedbrytning, samordnad av den samordnade verkan av äggstockshormonerna – östrogen och progesteron. Studier av genetiskt modifierade möss har avslöjat grundläggande biologiska mekanismer som ligger till grund för endometriesvaret på hormoner och kontroll av embryoimplantation, stromacelldecidualisering och graviditet1. In vitro-studier har dock varit begränsade på grund av svårigheter att upprätthålla icke-transformerade primära musendometrievävnader i traditionella 2D-cellkulturer 2,3. De senaste framstegen inom kulturen av endometriella vävnader som 3D-organsystem, eller organoider, utgör en ny möjlighet att undersöka biologiska vägar som kontrollerar endometrial cellregenerering och differentiering. Mus- och humana endometrieorganoidsystem har utvecklats från rent endometrieepitel inkapslat i olika matriser4,5, medan humant endometrium har odlats som ställningsfria epitel- / stromala samkulturer6,7, och mer nyligen som kollageninkapslade epitel- / stromalsammansättningar8 . Tillväxten och regenerativ potential hos epitelorganoidkulturer stöds av en definierad cocktail av tillväxtfaktorer och småmolekylära hämmare som har bestämts empiriskt för att maximera tillväxt och regenerering av organoiderna 4,5,9. Dessutom tillåter förmågan att frysa och tina endometrieorganoider långsiktig bankning av endometrieorganoider från möss och människor för framtida studier.

Genetiskt modifierade möss har avslöjat de komplexa signalvägarna som styr tidig graviditet och decidualisering och har använts som modeller för graviditetsförlust, endometriecancer och endometrios. Dessa genetiska studier har till stor del uppnåtts med cellspecifik radering av loxP-flankerade alleler (“floxed”) med hjälp av cre-rekombinaser som är specifikt aktiva i kvinnliga reproduktionsvävnader. Dessa musmodeller inkluderar den allmänt använda progesteronreceptor-cre 10, som har stark rekombinasaktivitet i endometrieepitel- och stromalvävnaderna, laktoferrin i-cre, som inducerar endometrieepitelrekombination hos vuxna möss11, eller Wnt7a-cre, vilket utlöser epitelspecifik radering i Müllerian-härledda vävnader12 . Odling av endometrievävnader från genetiskt modifierade musmodeller som 3D-organoider har gett ett utmärkt tillfälle att undersöka endometriebiologi och underlätta identifieringen av tillväxtfaktorer och signalvägar som styr endometrial cellförnyelse och differentiering13,14. Metoder för isolering och odling av musens endometrievävnad beskrivs i litteraturen och rapporterar användningen av olika enzymatiska strategier för isolering av livmoderepitel för efterföljande odling av endometrieepitelorganoider4. Medan tidigare litteratur ger en kritisk ram för endometrieepitelorganoidkulturprotokoll 4,5,6, ger detta papper en tydlig, omfattande metod för att generera, underhålla, bearbeta och analysera dessa organoider. Standardisering av dessa tekniker är viktigt för att påskynda framsteg inom kvinnors reproduktionsbiologi. Här rapporterar vi en detaljerad metodik för enzymatisk och mekanisk rening av mus endometrial epitelvävnad för efterföljande odling av endometrieorganoider i en gelmatrisställning. Vi beskriver också metoderna för nedströms histologiska och molekylära analyser av de gelmatrisinkapslade musendometriepitelorganoiderna.

Protocol

Mushantering och experimentella studier utfördes enligt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Baylor College of Medicine och riktlinjer som fastställts av NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 1. Isolering av livmoderepitel från möss med enzymatiska och mekaniska metoder OBS: Detta avsnitt beskriver de steg som krävs för att etablera, passera, frysa och tina epiteliala endometrieorgano…

Representative Results

Faskontrastbilder av musendometrieorganoiderVi etablerade organoider från WT-mus endometrieepitel, som beskrivs i det bifogade protokollet (se diagram i figur 1). Efter enzymatisk dissociation av musens endometriepitel separerades epitelark mekaniskt från livmoderstromacellerna och dissocierades ytterligare med kollagenas för att generera en encellssuspension. Om den utförs korrekt bör denna metod för epitel- och stromacellsseparation ge prover med kontaminering av…

Discussion

Här beskriver vi metoder för att generera endometrieepitelorganoider från musendometrium och de protokoll som rutinmässigt används för deras nedströmsanalys. Endometrieorganoider är ett kraftfullt verktyg för att studera de mekanismer som styr endometrierelaterade sjukdomar, såsom endometrios, endometriecancer och implantationsfel. Landmärkestudier som publicerades 2017 rapporterade villkoren för att odla långsiktiga och förnybara kulturer av endometrieorganoider från mus och humant epitel<sup class="xref"…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Dr. Stephanie Pangas och Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) för kritisk läsning och redigering av vårt manuskript. Studier stöddes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development bidrag R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) och R01-HD110038 (M.M.M.) och av NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. har ett Next Gen Pregnancy Award från Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women’s health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making – A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid&#34. Biologie. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Biologie du développement. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

3D Endometrial OrganoidsMouse UterusUterine EpitheliumEnzymatic DissociationMechanical DissociationCell CultureOrganoid EstablishmentCell PelletCollagenaseDNA Solution
check_url/fr/64448?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image