Denne protokollen beskriver metoder for å etablere endometrielle organoider for museepitelorganer for genuttrykk og histologiske analyser.
Endometrial vev linjer det indre hulrommet i livmoren og er under syklisk kontroll av østrogen og progesteron. Det er et vev som består av luminal- og kjertelepitel, et stromalt rom, et vaskulært nettverk og en kompleks immuncellepopulasjon. Musemodeller har vært et kraftig verktøy for å studere endometrium, og avslører kritiske mekanismer som styrer implantasjon, placentasjon og kreft. Den nylige utviklingen av 3D endometrial organoid kulturer presenterer en state-of-the-art modell for å dissekere signalveiene som ligger til grunn for endometrisk biologi. Etablering av endometrieorganoider fra genetisk utviklede musemodeller, analyse av transkriptomer og visualisering av morfologi ved encellet oppløsning er avgjørende verktøy for studiet av endometriesykdommer. Dette papiret skisserer metoder for å etablere 3D-kulturer av endometrisk epitel fra mus og beskriver teknikker for å kvantifisere genuttrykk og analysere organoidens histologi. Målet er å gi en ressurs som kan brukes til å etablere, dyrke og studere genuttrykk og morfologiske egenskaper av endometrielle epitelorganoider.
Endometrium – det indre slimhinnen i livmorhulen – er et unikt og svært dynamisk vev som spiller kritiske roller i en kvinnes reproduktive helse. Under reproduktiv levetid har endometrium potensialet til å gjennomgå hundrevis av sykluser av spredning, differensiering og sammenbrudd, koordinert av den samordnede virkningen av eggstokkhormonene – østrogen og progesteron. Studier av genmodifiserte mus har avdekket grunnleggende biologiske mekanismer som ligger til grunn for endometrieresponsen på hormoner og kontroll av embryoimplantasjon, stromalcelledecidualisering og graviditet1. In vitro-studier har imidlertid vært begrenset på grunn av vanskeligheter med å opprettholde ikke-transformert primært museendometrievev i tradisjonelle 2D-cellekulturer 2,3. Nylige fremskritt i kulturen av endometrievev som 3D-organsystemer, eller organoider, presenterer en ny mulighet til å undersøke biologiske veier som styrer endometriecelleregenerering og differensiering. Mus og humane endometriske organoidsystemer er utviklet fra rent endometrieepitel innkapslet i forskjellige matriser4,5, mens humant endometrium har blitt dyrket som stillasfrie epitel-/stromale kokulturer6,7, og mer nylig som kollageninnkapslede epitelial/stromale assembloider8 . Veksten og det regenerative potensialet til epitelorganoidkulturer støttes av en definert cocktail av vekstfaktorer og små molekylhemmere som er empirisk bestemt for å maksimere vekst og regenerering av organoidene 4,5,9. Videre tillater evnen til å fryse og tine endometrieorganoider den langsiktige banken av endometrieorganoider fra mus og mennesker for fremtidige studier.
Genmodifiserte mus har avslørt de komplekse signalveiene som styrer tidlig graviditet og decidualisering, og har blitt brukt som modeller for graviditetstap, endometriekreft og endometriose. Disse genetiske studiene er i stor grad oppnådd med cellespesifikk delesjon av loxP-flankerte alleler (“floxed”) ved bruk av cre recombinaser som er spesielt aktive i kvinnelig reproduktivt vev. Disse musemodellene inkluderer den mye brukte progesteronreseptor-cre10, som har sterk rekombinaseaktivitet i endometrieepitel- og stromalvevet, laktoferrin i-cre, som induserer endometrisk epitelrekombinasjon hos voksne mus11, eller Wnt7a-cre, som utløser epitelspesifikk delesjon i Müllerian-avledet vev12 . Dyrking av endometrievev fra genetisk utviklede musemodeller som 3D-organoider har gitt en utmerket mulighet til å undersøke endometrisk biologi og lette identifisering av vekstfaktorer og signalveier som styrer endometriecellefornyelse og differensiering13,14. Metoder for isolering og kultur av mus endometrievev er beskrevet i litteraturen og rapporterer bruken av ulike enzymatiske strategier for isolering av livmorepitel for etterfølgende dyrking av endometriske epitelorganoider4. Mens tidligere litteratur gir et kritisk rammeverk for endometrieepitelorganoidkulturprotokoller 4,5,6, gir dette papiret en klar, omfattende metode for å generere, vedlikeholde, behandle og analysere disse organoider. Standardisering av disse teknikkene er viktig for å akselerere fremskritt innen kvinners reproduktive biologi. Her rapporterer vi en detaljert metodikk for enzymatisk og mekanisk rensing av mus endometrial epitelvev for den etterfølgende kulturen av endometrieorganoider i et gelmatrisestillas. Vi beskriver også metodene for nedstrøms histologiske og molekylære analyser av gelmatrise-innkapslede mus endometrial epitelorganoider.
Her beskriver vi metoder for å generere endometrielle epitelorganoider fra musens endometrium og protokollene som rutinemessig brukes til nedstrømsanalyse. Endometrieorganoider er et kraftig verktøy for å studere mekanismene som kontrollerer endometrierelaterte sykdommer, som endometriose, endometriekreft og implantasjonssvikt. Landemerkestudier publisert i 2017 rapporterte forholdene til å dyrke langsiktige og fornybare kulturer av endometrieorganoider fra mus og humant epitel 4,5…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Stephanie Pangas og Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) for kritisk lesing og redigering av manuskriptet vårt. Studier ble støttet av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development tilskudd R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.), og R01-HD110038 (M.M.M.), og av NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. har en Next Gen Pregnancy Award fra Burroughs Wellcome Fund.
Organoid Media Formulation | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
Other supplies and reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |