Method Article

Une chambre flexible pour l’imagerie de cellules vivantes en accéléré avec microscopie à diffusion Raman stimulée

DOI:

10.3791/64449

⸱

August 31st, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Binghamton University, State University of New York

In This Article

Summary

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Nous rapportons une chambre environnementale flexible au sommet de l’étage pour l’imagerie accélérée de cellules vivantes à l’aide de la microscopie à diffusion Raman stimulée verticalement avec détection de signal transmis. Des gouttelettes lipidiques ont été imagées dans des cellules SKOV3 traitées à l’acide oléique pendant 24 heures avec un intervalle de temps de 3 minutes.

Abstract

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La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie chimique sans marquage. L’imagerie de cellules vivantes avec SRS a été démontrée pour de nombreuses applications biologiques et biomédicales. Cependant, l’imagerie SRS à long terme de cellules vivantes n’a pas été largement adoptée. La microscopie SRS utilise souvent un objectif d’immersion dans l’eau à grande ouverture numérique (NA) et un condenseur à immersion d’huile à haute NA pour obtenir une imagerie à haute résolution. Dans ce cas, l’écart entre l’objectif et le condensateur n’est que de quelques millimètres. Par conséquent, la plupart des chambres environnementales commerciales ne peuvent pas être utilisées pour l’imagerie SRS en raison de leur grande épaisseur avec un couvercle en verre rigide. Cet article décrit la conception et la fabrication d’une chambre flexible pouvant être utilisée pour l’imagerie de cellules vivantes en accéléré avec détection de signal SRS transmis sur un cadre de microscope vertical. La flexibilité de la chambre est obtenue en utilisant un matériau souple - un film mince de caoutchouc naturel. La nouvelle conception du boîtier et de la chambre peut être facilement ajoutée à une installation d’imagerie SRS existante. Les tests et les résultats préliminaires démontrent que le système de chambre flexible permet une imagerie SRS stable, à long terme et accélérée de cellules vivantes, qui peut être utilisée pour diverses applications de bioimagerie à l’avenir.

Introduction

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La microscopie optique est utilisée pour observer les microstructures des échantillons. L’imagerie optique est rapide, moins invasive et moins destructrice que les autres technologies1. L’imagerie de cellules vivantes avec microscopie optique est développée pour capturer la dynamique des cellules vivantes cultivées sur une longue période2. Différents types de contrastes optiques fournissent des informations distinctes sur les échantillons biologiques. Par exemple, la microscopie optique en phase montre la différence subtile dans les indices de réfraction à travers l’échantillon3. La microscopie à ....

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Protocol

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1. Construire l’enceinte environnementale du microscope

REMARQUE : Cette grande enceinte environnementale de microscope est utilisée pour contrôler la température du corps du microscope et de l’environnement d’imagerie à stabiliser à 37 °C (Figure 1A).

  1. Marquez l’emplacement des pieds du cadre du microscope SRS et de la platine motorisée à l’aide d’un marqueur sur la table optique. Montez deux diaphragmes d’iris devant le scanner Galvanomètre du microscope et ajustez-les pour que la pompe et les faisceaux laser Stokes passent par le centre des diaphragmes d’iris.
  2. Retirez le cadre du microscop....

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Results

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Nous avons fabriqué et assemblé le système de chambre flexible pour l’imagerie SRS time-lapse (Figure 1 et Figure 2), puis évalué les performances du système. La température à l’intérieur de l’enceinte environnementale du microscope a atteint les 37 °C attendus en 1 h, ce qui n’a pas affecté de manière significative la température ambiante (figure 3A). La température dans la chambre flexible a atteint 37 °C en 1,5 h, et elle a été m.......

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Discussion

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La microscopie SRS à cellules vivantes en accéléré est une technique d’imagerie alternative pour le suivi des molécules de manière sans marquage. Par rapport au marquage par fluorescence, l’imagerie SRS est exempte de photoblanchiment, ce qui permet une surveillance à long terme des molécules. Cependant, à ce jour, le système d’imagerie de cellules vivantes sur une microscopie SRS verticale n’est pas disponible dans le commerce. Dans ce travail, un système d’imagerie de cellules vivantes avec une boîte de boîtier de micr.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

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Nous tenons à remercier l’équipe de conception principale de premier cycle 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza et James Walsh) de l’Université de Binghamton pour la conception, la fabrication et les tests de la boîte d’enceinte de microscope. Nous remercions Scott Hancock, Olga Petrova et Fabiola Moreno Olivas de l’Université de Binghamton pour leurs discussions utiles. Cette recherche a été soutenue par les National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R15GM140444.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Un microscope SRS de laboratoirehttps://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in amplierZurich InstrumentsHF2LI
Diaphragme à irisThorlabs IncSM1D12
Monture à miroir cinématiqueThorlabs IncKM100
Monture de microscopeNikon IncFN-1
Platine de microscopie motoriséePrior ScientificZ-Deck
(C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)Objectifà immersion dans l’eau MBL71405
(CFI75 Apo 25XC W 1300)Nikon IncMRD77225
Matériaux et pièces pour le boîtier du microscope (31'' x 29'' x 28'' L x l x H)
Module de chauffage AirthermWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SAT-1W
Contrôleur de chauffage Airtherm, moniteur <>2 et humiditéWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SMT-1W
Module mélangeur air/CO2World Precision Instruments (WPI)ECU-HOC-W
Boyau flexible pour conduits (2-1/2'' DI, 2-3/4'' OD)McMaster-Carr56675K71
Verre-mica céramique haute température, facile à usiner (6'' x 6'', 1/4'' d’épaisseur)McMaster-Carr8489K62
Feuilles de polycarbonate (épaisseur 0.25'')McMaster-Carr8574K286
Feuilles de caoutchouc de silicone (36'' x 36'', épaisseur 1/8'')McMaster-Carr5827T43
Matériaux et pièces pour la chambre flexible
Plaque chauffanteMcMaster-Carr31745K11
Filtre en ligne haute pureté, 1/4 NPTMcMaster-Carr6645T18
Scie cloche (diamètre de coupe 1-7/8 po)McMaster-Carr4066A34
Scie-cloche (diamètre de coupe 50 mm)McMaster-Carr4556A19
Tube en caoutchouc de silicone haute température, souple, 2 mm de diamètre intérieur, 5 mm de diamètre extérieurMcMaster-Carr5054K313
Filtre en ligne (1/4 NPT, 40 micron)McMaster-Carr98385K843
Tube rond polyvalent en aluminium 6061 (épaisseur de paroi de 1/8'', 4' ' OD)McMaster-Carr9056K42
Tube rond polyvalent en aluminium 6061 (épaisseur de paroi 3/4'', 3-3/4'' OD)McMaster-Carr9056K47
Barre d’aluminium polyvalente 6061 (12'' x 12'', épaisseur 1/4'')McMaster-Carr8975K142
Barre d’aluminium 6061 polyvalente (8'' x 8'', épaisseur 3/8' ')McMaster-Carr9246K21
Objectif porte-objectifs (simple)Nikon IncFN-MN-H
Porte-échantillon (modifié)Prior ScientificHZ202
Film de caoutchouc naturel ultra-mince (épaisseur 0.01'')McMaster-Carr8611K13
Pot en verre scellable sous videMcMaster-Carr3231T44
Software
MATLAB MathWorks
ImageJ (Fiji)imagej.net
ScanImageVidrio Technologies, LLCLogiciel d’imagerie SRS
Materials for live-cell imaging
Cover boîtes de culture stériles à fond de verre (Dia.x H, 50 x 7 mm)Electron Microscopy Sciences (EMS)70674-02
Milieu de culture cellulaire DMEMThermoFisher Scientific11965092
Sérum fœtal bovin (FBS)ThermoFisher Scientific26140079
LysoSensor colorant fluorescent DND-189ThermoFisher ScientificL7535 (Invitrogen)
Acide oléiqueMilliporeSigma364525
Lignée cellulaire SKOV3ATCCHTB-77
Condenseur à immersion dans l’huile Nikon Inc

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
  2. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  3. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.

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Stimulated Raman ScatteringSRS MicroscopyLive Cell ImagingTime Lapse ImagingFlexible ChamberEnvironmental ChamberHigh Numerical ApertureLipid Droplet ImagingTwo Photon FluorescenceCell Culture

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