Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere den fysiologiske betydningen av virkningen av brunt fettvev (BAT) aktivitet på menneskelig metabolisme. Dette oppnås ved å kombinere karbohydratbelastning og indirekte kalorimetri med målinger av supraklavikulære temperaturendringer. Denne nye tilnærmingen kan bidra til å utvikle et farmakologisk mål for BAT-termogenese hos mennesker.
Hos pattedyr aktiveres brunt fettvev (BAT) raskt som respons på kulde for å opprettholde kroppstemperaturen. Selv om BAT har blitt studert sterkt hos små dyr, er det vanskelig å måle aktiviteten til BAT hos mennesker. Derfor er lite kjent om varmegenererende kapasitet og fysiologisk betydning av BAT hos mennesker, inkludert i hvilken grad komponenter i dietten kan aktivere BAT. Dette skyldes begrensningene i den for tiden mest brukte metoden for å vurdere aktivering av BAT-radiomerket glukose (fluorodeoksyglukose eller 18FDG) målt ved positronemisjonstomografi-datastyrt tomografi (PET-CT).
Denne metoden utføres vanligvis hos fastende personer, da fôring induserer glukoseopptak av musklene, noe som kan maskere glukoseopptaket i BAT. Denne rapporten beskriver en detaljert protokoll for kvantifisering av totale kropps menneskelige energiforbruk og substratutnyttelse fra BAT-termogenese ved å kombinere indirekte kalorimetri, infrarød termografi og blodsukkermåling hos karbohydratbelastede voksne menn. For å karakterisere den fysiologiske betydningen av BAT, er tiltak av virkningen av BAT-aktivitet på menneskers helse kritiske. Vi demonstrerer en protokoll for å oppnå dette ved å kombinere karbohydratbelastning og indirekte kalorimetri med målinger av supraklavikulære temperaturendringer. Denne nye tilnærmingen vil bidra til å forstå fysiologien og farmakologien til BAT-termogenese hos mennesker.
Brunt fettvev (BAT) skiller seg spesielt fra hvitt fettvev (WAT) i dets mitokondrielle innhold, sympatisk innervering, multilokulære lipiddråper, varmegenererende evne og anatomisk fordeling. BAT ble ansett å eksistere bare hos spedbarn og små pattedyr til bekreftelsen av sin tilstedeværelse hos voksne mennesker i 2009 1,2,3. Således, inntil relativt nylig, har BATs rolle i menneskelig fysiologi og metabolsk homeostase blitt dårlig forstått. Omfattende studier på små dyr har vist at under kald eksponering skyldes mer enn halvparten av metabolismen den ikke-rystende termogene evnen til BAT4. Flere studier har vist at ved mild kuldeeksponering (17-18 °C) korrelerer økning i energiforbruk og glukoseopptak i BAT sterkt med BAT-termogenese hos mennesker 5,6,7. Videre kan BAT-termogenese bidra med opptil 10% av hvileenergiforbruket hos mennesker under kald eksponering (for en gjennomgang, se Van Schaik et al.8). Studier av fysiologi og innvirkning av BAT på menneskers helse og sykdom er for tiden begrenset av protokollbegrensninger. Det er derfor viktig å ha en nøyaktig metode for å måle den sanne metabolske effekten av BAT for bedre å forstå virkningen av BAT-termogenese på fedme og dens metabolske komplikasjoner hos mennesker.
Den anatomiske fordelingen av human BAT gjør det utfordrende å oppnå nøyaktige målinger av BAT. Hos mennesker er BAT fordelt inne i depotene til WAT i magen, thorax, og spesielt halsen9. Obduksjon og kadaveriske studier har blitt brukt for å karakterisere BAT anatomisk10,11, men disse metodene kan ikke gi funksjonell informasjon. Det er utfordrende å skille BAT ved hjelp av konvensjonelle avbildningsteknikker på grunn av de samme tetthetene til WAT og BAT8. Et ytterligere forvirrende problem er at beige fettdepoter også ligger innenfor de samme smale lagene av fascia eller i visse depoter med WAT8, noe som gjør det utfordrende å skille ved hjelp av konvensjonelle bildebehandlingsteknikker.
For å overvinne dette problemet måles BAT-volumet vanligvis ved å kombinere positronutslippstomografi (PET) og computertomografi (CT). Den radiomerkede glukoseanalogen 18 F-fluourodeoksyglukose (18F-FDG) er det vanligste sporstoffet som brukes til å studere BAT 12. Imidlertid lider det av flere begrensninger, for eksempel å utsette for ioniserende stråling og være invasiv og dyr. I tillegg er den største begrensningen til 18F-FDG-sporstoffet at det måler opptaket av en glukoseanalog, noe som ikke er ideelt gitt at frie fettsyrer er de foretrukne substratene for BAT-termogenese13. 18F-FDG PET/CT-teknikken måler ikke opptaket av frie fettsyrer som substrat for termogenese, og måler derfor ikke den fysiologiske betydningen av BAT-termogenese. Det finnes alternative teknikker som brukes til å vurdere human BAT, som inkluderer måling av opptaket av oksygen-15 merket vann (15 O-O2) 14,11 C-acetat 15, en langkjedet fettsyre (18 F-fluor-6-thia-heptadecanoic syre) 16 eller adenosin 17, samt magnetisk resonans spektroskopi 18 og magnetisk resonans imaging 19, men disse er fortsatt ekstremt dyre og utsetter for ioniserende stråling. Derfor mangler en pålitelig, billig og viktigere, sikker gullstandard for kvantifisering av menneskelig BAT.
Infrarød termografi (IRT) er en alternativ ikke-invasiv bildebehandlingsteknikk20,21 som måler hudtemperaturen over et kjent BAT-depot. Selv om dette medfører økt energiforbruk, hvis den målte temperaturen ikke overstiger kjernetemperaturen, kan det ikke bestemmes om den målte temperaturendringen bare er en konsekvens av endret blodstrøm. Videre gir en målt økning i lokal temperatur ikke verdier for endret energiforbruk, som ofte er det ønskede endepunktet. En rekke forskningsgrupper har brukt IRT til å måle en økning i temperaturen i depoter av human BAT etter en koffeinintervensjon eller kuldestimulus; Dette depotet er den supraklavikulære fossa 22,23,24,25,26,27.
Det er imidlertid ikke klart om virkningen av koffein på BAT er direkte eller mediert via nevrale kretser. Det er tegn på at koffein induserer bruningsegenskaper i adipocytter in vitro22, og tidligere arbeid har vist at koffein (100 mg) øker hjertefrekvensvariabiliteten, noe som kan være en indikator på en økning i sympatisk nervedrift systemisk i kroppen27. Dette er i tråd med evidens hos gnagere, der koffein via sentralnervesystemet øker termotilblivelsen uten uheldig kardiodynamisk påvirkning28.
Siden det foretrukne substratet for BAT-termogenese er frie fettsyrer avledet fra triglyserider13, og aktive BAT-sekvestrere som sirkulerer lipider for å opprettholde termogenese29, er tiltak for substratutnyttelse viktig for å vurdere den fysiologiske aktiveringen av BAT. Respiratorisk utvekslingsforhold (RER) er forholdet mellom volumet av oksygen som forbrukes (V̇O 2) og karbondioksid produsert (V̇CO2) 30. En RER på 0,7 indikerer fettsyremetabolismen, og en RER på 1,0 indikerer karbohydratmetabolismen31. Derfor er bevis på en preferanse for fettsyreutnyttelse utover en økning i energiforbruket et nøkkelkorrelat for BAT-termogenese.
I tillegg, gitt at opptaket av glukose er et kjent korrelat av BAT-aktivitet (se ovenfor), er et fall i blodsukker parallelt med endringen i substratutnyttelse nøkkelkorrelater for BAT-termogenese. Tidligere studier som bruker indirekte kalorimetri alene, eller sammen med temperaturregistrering hos fastende individer, har rapportert liten eller ingen akutt endring i substratutnyttelse32,33. Siden dette sannsynligvis maskeres av den fastende tilstanden (hvor preabsorberende metabolisme favoriserer fettutnyttelse), foreslår vi å kombinere IRT og indirekte kalorimetri med karbohydratbelastning.
Denne artikkelen tar sikte på å gi en trinnvis tilnærming som kliniske forskere kan bruke til pålitelig og, viktigere, trygt kvantifisere den fysiologiske betydningen av BAT hos mennesker ved å kombinere IRT, indirekte kalorimetri og blodsukkernivå. Denne teknikken brukes best etter at forsøkspersoner har blitt karbohydratbelastet og utsatt for enten farmakologiske BAT-midler eller miljøstimuli. Resultatene av denne tilnærmingen kan brukes til å studere BAT-aktivitet, substratutnyttelse og energiforbruk etter aktivering av BAT hos individuelle studiepersoner27.
Metoden vi har vist her er en teknisk enkel, sikker og kostnadseffektiv protokoll for måling av BAT-termogenese hos mennesker. Protokollen adresserer bekymringer knyttet til påliteligheten av å bruke IRT alene for å skille mellom lokal oppvarming på grunn av endret blodstrøm i huden og dypere oppvarming på grunn av termogenese ved å korrelere IRT med både målinger av energiforbruk (EE) og substratutnyttelse. Siden denne teknikken ikke bruker ioniserende stråling, tillater den analyse av gjentatte tiltak, noe som ikke er mulig med PET-bildebehandlingsteknikker. Til slutt, mens PET-bildebehandlingsteknikker kan identifisere BAT-aktivering, rapporterer de ikke om de fysiologiske resultatene (økt temperatur og EE) som denne protokollen måler.
Styrken til protokollen beskrevet her er at det er fire bevislinjer som støtter konklusjonen av fremkalt BAT-termogenese: (1) økt målt Tscf, parallelt med uendret kjernetemperatur og stabil hudtemperatur over det tilstøtende referanseområdet; (2) økt energiforbruk; (3) en endring i substratutnyttelse; og (4) et fall i blodsukkernivået. De konvergerende observasjonene er alle konsistente med de forutsagte resultatene for BAT-termogenese. Den essensielle delen av protokollen er karbohydratbelastningen til deltakerne for å sikre karbohydratmetabolismen før intervensjon. BAT-termogenese bytter substratmetabolisme fra karbohydrater til frie fettsyrer, som vist ved fallet i RER. Mens det foretrukne substratet for BAT-termogenese er frie fettsyrer, er et signifikant opptak av glukose i aktiv BAT veletablert 5,6,7. Derfor observerer vi et fall i blodsukkernivået samtidig med BAT-termogenesen. Det ville ikke være mulig å observere det gjensidige skiftet i substratutnyttelse (RER) og fallet i blodsukkernivået i fastende tilstand.
Tidligere studier har konkludert med at økt Tscf (målt ved IRT) er tilstrekkelig til å konkludere med BAT-termogenese. Denne konklusjonen er imidlertid bare sikker hvis Tscf overskrider kjernetemperaturen. Hvis Tscf er mindre enn eller lik kjernetemperaturen, kan en lokal temperaturendring på grunn av økt blodgjennomstrømning i huden ikke utelukkes. En systematisk oversikt konkluderte med at IRT alene ikke er i stand til å avgjøre om økning i supraklavikulær hudtemperatur skyldes BAT-termogenese37. Gjennomgangen bemerket at den vanligste metoden (18F-FDG PET / CT) måler opptaket av glukose i BAT37. Imidlertid er det foretrukne substratet for BAT-termogenese fettsyrer13. Dette metodologiske problemet forhindrer enhver meningsfull sammenligning mellom PET/CT-data ved validering av IRT-data, da noen av disse målingene alene ikke er et egnet mål på den sanne metabolske aktiviteten til BAT, da det ikke kan indikere endringen i energiforbruk og substratutnyttelse på grunn av BAT-termogenese. Likevel, med protokollen beskrevet her, kan vi ikke bare kvantifisere temperaturendringen, men vi kan også bekrefte en økning i energiforbruket – et viktig fysiologisk resultat av BAT-termogenese. IRT er en kontaktfri, ikke-invasiv og relativt billig metode for måling av temperatur- og temperaturendringer forbundet med BAT-termogenese. I motsetning til dette er PET-CT dyrt og utsetter individer for ioniserende stråling, og begrenser dermed anvendeligheten av denne metoden til små retrospektive analyser av kliniske bildestudier. Anvendelsen av dagens protokoll på store, randomiserte kliniske studier vil være relativt enkel og kostnadseffektiv.
Det er viktig å merke seg at reduksjonen i karbohydratoksidasjon etter koffeinintervensjon kan forklares av bryteren i substratutnyttelse som følge av økt BAT-termogenese på grunn av intervensjonen. Tiltak av insulinsignalering vil gjøre resultatene av denne studien mer robuste. Det er imidlertid ikke klart basert på resultatene av denne studien om koffein vil påvirke insulinsignalering via virkning på BAT eller om fallet i blodsukker er et resultat av at BAT tar opp flere energisubstrater.
18F-FDG PET/CT-metoden har flere iboende begrensninger når den brukes til å kvantifisere og måle den fysiologiske aktiviteten til BAT, spesielt når man undersøker påvirkningen av næringsstoffer eller diettingredienser på BAT-aktivitet. 18F-FDG PET/CT-metoden krever at forsøkspersonene fastes for å unngå fôringsinduserte økninger i glukoseopptak i muskelvevet, noe som kan redusere deteksjonen av både BAT- og BAT-funksjonenbetydelig 38. Videre kan denne teknikken alene ikke måle den fysiologiske effekten eller omfanget av BAT-aktivering. I tillegg er bruken av ioniserende stråling i PET-bildestudier en etisk og helse- og sikkerhetshindring for å designe gjentatte tiltak cross-over-studier. I tillegg representerer 18F-FDG kun glukoseopptak, noe som ikke er det samme som å måle glukosemetabolismen. Denne metoden for karbohydratbelastende personer før måling av BAT-temperaturen og kombinasjon av blodsukkernivåer med indirekte kalorimetri gjør at vi grundig kan måle den fysiologiske effekten av termogenese og endret substratutnyttelse, som ellers ikke ville være tilgjengelig i fastende tilstand.
Styrker og begrensninger
Denne protokollen har bredere implikasjoner enn bare å studere BAT. Ved karbohydratladende deltakere før intervensjon kan svingning av blodsukkernivåer som respons på både karbohydratbelastning og koffeinintervensjon, samt endringer i substratutnyttelse, observeres. Derfor kan denne teknikken brukes til å forbedre menneskelige indirekte kalorimetristudier og metabolske tiltak. Det er ennå ikke kjent om resultatene fra denne studien kan replikeres etter andre tiltak, for eksempel kald eksponering eller adrenerg stimulering. Resultatene av denne studien har imidlertid blitt replikert etter intervensjon med en annen diettingrediens, nemlig Capsicum annuum27. Ytterligere strenghet og tillit til resultatene kan oppnås ved hjelp av en dobbeltblind tilnærming for analyse av tiltak ved hjelp av teknikkene som er beskrevet, og dette kan lett implementeres27.
Den potensielle konfunderingen av variert romtemperatur er ikke relevant i denne protokollen, da romtemperaturen ble holdt stabil fra deltaker til deltaker. I tillegg ble fuktigheten tatt i betraktning under kalibreringen av respiratorisk gassanalysator. Dette utledes i oppsettet av dette utstyret, da kalibreringen er fullført i henhold til produsentens instruksjoner.
Tidsintervallene for måling og behandling ble bestemt etter en liten pilotstudie der feilsøking av protokollen ble gjennomført. I hovedsak ble tidsintervallene for måling bestemt basert på tiden det tok for forskeren å utføre målingene og for deltakerens komfort. Tidspunktet for intervensjonen ble bestemt basert på tiden det tok før karbohydratmetabolismen inntraff etter karbohydratbelastningen for å undersøke om intervensjonen økte fri fettsyreoksidasjon (dvs. BAT-termogenese) og senket karbohydratoksidasjon.
Spesielt er det forskjeller mellom kapillære og venøse glukosenivåer39. Imidlertid, i sammenheng med behandling utenfor sykehus, er den vanligste måten blodsukkernivået måles på via en blodprøve av kapillær opprinnelse analysert av et håndholdt, point-of-care glucometer40. I tillegg er det hos friske individer (tilsvarende de som er inkludert i denne protokollen) i en ikke-klinisk setting, en statistisk signifikant, men ikke klinisk signifikant forskjell mellom kapillære og venøse blodsukkernivåer målt ved hjelp av et pasientnært, kapillærbasert glukometer41. I denne sammenheng vil kapillær prøvetaking forbli den optimale tilnærmingen på grunn av det faktum at de fleste point-of-care glukometre tilgjengelig på markedet er konstruert for å analysere kapillære blodprøver41. Fra et klinisk perspektiv kan det hevdes at venøst blodsukker er den overlegne analysemetoden. Venøs blodprøvetaking er imidlertid ikke bare dyrt og krever spesialutstyr (ibid), men det er også invasivt. De etiske vurderingene om å øke risikoen for uønskede hendelser under protokollen må balanseres mot rapportert litteratur som viser den høye korrelasjonen og påliteligheten av kapillær blodsukker som et proxy-mål for venøs blodsukker42. Nøkkelen her er selvfølgelig at vi ikke har satt ut for å diagnostisere diabetes, men å måle endringer i blodsukkernivå, for hvilken kapillær blodsukkermåling er en mer enn egnet protokoll.
Glukose kan indusere termogenese, og enkeltmåltider kan aktivere BAT43. Imidlertid, og ganske viktig, viser dataene inkludert i dette manuskriptet ingen signifikant effekt av glukosebelastning i intervensjonsgruppen eller placebogruppen. Videre var dataene i manuskriptet hentet fra resultatene til Van Schaik og medarbeidere, som inkluderte et tredje inngrep (Capsicum annuum), og glukosebelastningen ga ingen signifikant effekt på tiltakene27.
Det skal bemerkes at denne protokollen bare har blitt brukt hos mannlige deltakere med lavt kroppsfett og aktiv BAT (for å redusere antall kontrollerbare variabler ble kvinner ekskludert fra studien). Det er en kjent invers korrelasjon mellom adipositet og BAT-masse hos mennesker44. I tillegg er det kjent at tidligere overvektige mennesker som har gått ned i vekt gjennom kosthold og mosjon, har en lavere basal metabolsk hastighet og må konsumere lavere kalori dietter for å opprettholde en normal vekt45,46. Videre kan BAT-aktivitet stimulere BAT-vekst8. Metoden beskrevet her vil tillate langsiktige studier for å undersøke endringer i BAT-aktivitet forbundet med metabolske sykdommer på en måte som ikke er gitt av andre teknikker.
Konklusjon
Avslutningsvis demonstrerer vi en målemetode for å kvantifisere human brun fettvevsaktivitet ved bruk av IRT og indirekte kalorimetri etter en karbohydratbelastning. De kritiske trinnene inkluderer 1) karbohydratbelastning av deltakerne som er i fastende tilstand før måling av BAT-temperaturen, mens de kombinerer indirekte kalorimetri og blodsukkernivå for å tillate kvantifisering av den fysiologiske utstrekningen av BAT-termogenese og endret substratutnyttelse; 2) vurdere relevante IRT BAT-depoter og temperaturer fra et referansepunkt og kjernetemperatur for å demonstrere enhver økning i Tscf som kan indikere BAT-aktivering basert på den anatomiske plasseringen. Vi tror at disse kvantitative målingene tillater en mer nøyaktig evaluering av bidraget fra BAT til voksen menneskelig energimetabolisme og termoregulering. Denne grundige tilnærmingen bør brukes av forskere til å studere BAT-fysiologi og tjene som en ny standard for å utvikle menneskelige BAT-aktiveringstilnærminger i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke alle frivillige i studien for deres deltakelse i studien vår. Dette arbeidet ble støttet av Holsworth Research Initiative, La Trobe University og Defence Science Institute (DSI, Australia).
Automated Sphygmomanometer | Omron SEM-2 advanced, Omron, Kyoto, Japan | ||
Dual-energy X-ray absorptiometry scanner | Hologic Horizon, Hologic Inc., Bedford, MA, USA | ||
ECG electrodes | Ambu Blue Sensor R, Malaysia | ||
Five lead ECG | Medilog AR12 plus; Schiller, Germany | ||
FLIR E60 camera | FLIR Systems Australia, Melbourne , Australia | ||
FLIR Research Studio Professional Edition | FLIR Systems Australia, Melbourne , Australia | ||
Freestyle Optium Xceed | Abbott Diabetes Care, Alameda, Canada | ||
Glucose Gel | Winners Sports Nutrition, Mt Martha, Victoria, Australia | ||
MaskA cold-sterilized silicone mask | 7400 series Oro-Nasal Mask, Hans Rudolph | ||
Medilog Darwin2 software | Professional; Schiller, Germany | ||
Non-contact Infrared Thermometer | Berrcom, JXB-178, Guangdong, China | ||
Optium Glucose Strip Xceed | Abbott Diabetes Care, Alameda, Canada | ||
ParvoMedics TrueOne 2400 respiratory gas analyser | ParvoMedics Inc, East Sandy, UT, USA | ||
Pre-sterilized Non-rebreathing Valve | Two-way non-rebreathing valve T-Shape configuration, 2600 Medium or 2700 Large, Hans Rudolph |