In vitro Metode til at studere kønsbaserede forskelle i konjunktivale bægerceller
Summary
Phenol rødfrit / føtalt bovint serumfrit medium er en bedre mulighed end avanceret RPMI for at eliminere eksogene hormoner uden at ændre den normale funktion af konjunktivale bægerceller i undersøgelsen af kønsbaserede forskelle.
Abstract
Tørre øjne er en multifaktoriel sygdom, der påvirker okulær overfladesundhed, med en dybt højere forekomst hos kvinder. Forstyrrelse af den geldannende mucin, der udskilles af konjunktivale bægerceller (CGC’er) på den okulære overflade, bidrager til flere okulære overfladesygdomme. Eliminering af eksogene kønshormoner er afgørende for at opnå konsistente resultater under in vitro-undersøgelse af kønsbaserede forskelle i CGC’er. Dette papir beskriver en metode til at minimere tilstedeværelsen af eksogene hormoner i undersøgelsen af kønsbaserede forskelle i CGC’er, samtidig med at deres fysiologiske funktion opretholdes. CGC’er fra postmortem humane donorer af begge køn blev dyrket fra stykker af bindehinden i RPMI-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) (kaldet det komplette medium) indtil sammenløb. Næsten 48 timer før forsøgenes start blev CGC’er overført til RPMI-medium uden phenolrød eller FBS, men med 1% BSA (kaldet phenol-rødfrit medium). Den normale cellulære funktion blev undersøgt ved at måle stigningen i intracellulær [Ca 2+] ([Ca 2+]i) efter carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulering ved hjælp af fura 2/acetoxymethyl (AM) mikroskopi. Resultatet viser, at CGC’er opretholdt normal funktion i de phenol-rødfrie medier efter 48 timer. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i [Ca2+]i-respons mellem phenolrødfrit RPMI-medium og komplet medium ved Cch-stimulering. Derfor anbefaler vi at bruge det phenolrøde frie RPMI-medium med 1% BSA til at eliminere eksogene hormoner uden at ændre CGC’ernes normale funktion i undersøgelsen af kønsbaserede forskelle.
Introduction
Kønsbaserede forskelle påvirker flere processer på den okulære overflade 1,2,3. Den kliniske manifestation af disse kønsbaserede forskelle er forskellen i forekomsten af mange okulære overfladesygdomme mellem mænd og kvinder, såsom tørre øjne og konjunktivitis 4,5,6. Beviser tyder på, at kønsbaserede forskelle stammer fra flere biologiske niveauer, herunder de forskellige profiler af gener på X- og Y-kromosomer7 og virkningerne af hormoner8. At studere det molekylære grundlag for kønsbaserede forskelle kan give en bedre forståelse af sygdom og i sidste ende forbedre personlig medicin.
Den okulære overflade omfatter den overliggende tårefilm, hornhinde og bindehinde. Kønsbaserede forskelle observeres i flere komponenter i den okulære overflade, herunder tårefilmen 9,10, hornhinden 11, lacrimalkirtlen 12,13 og meibomiske kirtler, der også udskiller tårer 12. Talrige mekanistiske undersøgelser har undersøgt virkningen af kønshormoner på hornhinden og dens tilknyttede komponenter14,15; Imidlertid er der lidt kendt om de kønsbaserede forskelle i bindehinden og dens bægerceller. Konjunktiva er en slimhinde, der dækker sclera og den indre overflade af øjenlåget. Bindehindens epitel består af ikke-keratiniserende, flerlags, stratificerede pladeceller16.
Blandt de stratificerede pladeceller i bindehinden er der bægerceller (CGC’er) ispedd epithelets apikale overflade. Disse bægerceller er kendetegnet ved det store antal sekretoriske granulater placeret ved den apikale pol17. CGC’er syntetiserer og udskiller den geldannende mucin MUC5AC for at fugte den okulære overflade og smøre den under blinkende17. Mucinsekretion reguleres tæt af den intracellulære [Ca 2+] ([Ca2+]i) og aktiveringen af den Ras-afhængige ekstracellulære signalregulerede kinase (ERK1/2)18. Manglende evne til at udskille mucin resulterer i tørhed af den okulære overflade og følgevirkninger af patologiske abnormiteter. På en betændt okulær overflade fører omfattende mucinsekretion stimuleret af inflammatoriske mediatorer imidlertid til en opfattelse af klæbrighed og kløe i øjet19. Disse tilstande med forstyrret mucinsekretion vil i sidste ende føre til forringelse af den okulære overflade.
Bægercellernes rolle som den vigtigste kilde til okulær mucin har længe været anerkendt20, men de kønsbaserede forskelle i mucinregulering i både fysiologiske og patologiske tilstande forbliver uopdagede. Et in vitro-system ville være nyttigt til at overvåge bægercellernes funktion uden hormonel virkning eller med et præcist kontrolleret niveau af kønshormoner. Selvom en konjunktival epitelcellelinje har udviklet21, er der ingen bægercellelinje med funktionel mucinsekretion tilgængelig. Derfor ændrede vi vores udviklede primære humane CGC-kultur for at etablere en metode til at analysere den kønsbaserede forskel in vitro16 og præsentere den som nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersøgelse af kønsbaserede forskelle i okulært væv hjælper med at forstå sygdomsprocesserne, især tørre øjne og allergisk konjunktivitis, som uforholdsmæssigt påvirker et køn 4,5,6. Selvom dyremodeller kan bruges til disse undersøgelser, er data opnået direkte fra humant væv afgørende på grund af den højeste lighed med de humane celler in vivo. Det konjunktivvæv, der anvendes i den nuværende eksper…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet er finansieret af National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
