In vitro Methode zur Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in Bindehautbecherzellen
Summary
Phenolrotfreies/fetales Rinderserum-freies Medium ist eine bessere Option als fortschrittliches RPMI, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion der Bindehautbecherzellen bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.
Abstract
Trockenes Auge ist eine multifaktorielle Erkrankung, die die Gesundheit der Augenoberfläche beeinträchtigt, mit einer deutlich höheren Prävalenz bei Frauen. Die Störung des gelbildenden Mucins, das von Bindehautbecherzellen (CGCs) auf die Augenoberfläche abgesondert wird, trägt zu mehreren Erkrankungen der Augenoberfläche bei. Die Eliminierung exogener Sexualhormone ist unerlässlich, um konsistente Ergebnisse bei der In-vitro-Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden in CGCs zu erhalten. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Minimierung des Vorhandenseins exogener Hormone bei der Untersuchung geschlechtsspezifischer Unterschiede in CGCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer physiologischen Funktion. CGCs von postmortalen menschlichen Spendern beiderlei Geschlechts wurden aus Stücken der Bindehaut in RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) (als vollständiges Medium bezeichnet) bis zur Konfluenz kultiviert. Knapp 48 Stunden vor Beginn der Versuche wurden CGCs in RPMI-Medium ohne Phenolrot oder FBS, aber mit 1% BSA (als phenolrotfreies Medium bezeichnet) überführt. Die normale zelluläre Funktion wurde untersucht, indem der Anstieg des intrazellulären [Ca 2+] ([Ca2+]i) nach Carbachol-Stimulation (Cch, 1 x 10-4 M) mittels Fura-2/Acetoxymethyl (AM)-Mikroskopie gemessen wurde. Das Ergebnis zeigt, dass CGCs nach 48 h ihre normale Funktion in den phenolrotfreien Medien aufrechterhielten. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der [Ca2+]i-Reaktion zwischen phenolrotfreiem RPMI-Medium und vollständigem Medium nach Cch-Stimulation beobachtet. Daher empfehlen wir die Verwendung des phenolrotfreien RPMI-Mediums mit 1% BSA, um exogene Hormone zu eliminieren, ohne die normale Funktion von CGCs bei der Untersuchung von geschlechtsspezifischen Unterschieden zu verändern.
Introduction
Geschlechtsspezifische Unterschiede betreffen mehrere Prozesse der Augenoberfläche 1,2,3. Die klinische Manifestation dieser geschlechtsspezifischen Unterschiede ist der Unterschied in der Prävalenz vieler Augenoberflächenerkrankungen zwischen Männern und Frauen, wie z. B. trockenes Auge und Bindehautentzündung 4,5,6. Es gibt Hinweise darauf, dass geschlechtsspezifische Unterschiede auf mehreren biologischen Ebenen entstehen, einschließlich der unterschiedlichen Profile von Genen auf X- und Y-Chromosomen7 und der Wirkung von Hormonen8. Die Untersuchung der molekularen Grundlagen geschlechtsspezifischer Unterschiede kann zu einem besseren Verständnis von Krankheiten beitragen und letztendlich die personalisierte Medizin verbessern.
Die Augenoberfläche besteht aus dem darüber liegenden Tränenfilm, der Hornhaut und der Bindehaut. Geschlechtsspezifische Unterschiede werden in mehreren Komponenten der Augenoberfläche beobachtet, darunter der Tränenfilm 9,10, die Hornhaut 11, die Tränendrüse 12,13 und Meibom-Drüsen, die ebenfalls Tränen absondern, 12. Zahlreiche mechanistische Studien haben die Wirkung von Sexualhormonen auf die Hornhaut und ihre assoziierten Bestandteile untersucht14,15; Über die geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Bindehaut und ihren Becherzellen ist jedoch wenig bekannt. Die Bindehaut ist eine Schleimhaut, die die Sklera und die Innenfläche des Augenlids bedeckt. Das Epithel der Bindehaut besteht aus nicht-keratinisierenden, mehrschichtigen, geschichteten Plattenepithelzellen16.
Unter den geschichteten Plattenepithelzellen der Bindehaut befinden sich Becherzellen (CGCs), die an der apikalen Oberfläche des Epithels eingestreut sind. Diese Becherzellen zeichnen sich durch die große Anzahl von sekretorischen Granula aus, die sich am apikalen Pol17 befinden. CGCs synthetisieren und sezernieren das gelbildende Mucin MUC5AC, um die Augenoberfläche zu befeuchten und sie während des Blinzelns zu schmieren17. Die Mucinsekretion wird durch das intrazelluläre [Ca2+] ([Ca2+]i) und die Aktivierung der Ras-abhängigen extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK1/2)18 stark reguliert. Die Unfähigkeit, Muzin abzusondern, führt zu Trockenheit der Augenoberfläche und zu pathologischen Anomalien. Auf einer entzündeten Augenoberfläche führt jedoch eine durch Entzündungsmediatoren angeregte übermäßige Muzinsekretion zu einer Wahrnehmung von Klebrigkeit und Juckreiz des Auges19. Diese Zustände mit gestörter Muzinsekretion führen schließlich zu einer Verschlechterung der Augenoberfläche.
Die Rolle von Becherzellen als Hauptquelle für Augenschleim ist seit langem bekannt20, jedoch sind die geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Muzinregulation sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Zuständen noch unentdeckt. Ein In-vitro-System wäre nützlich, um die Funktion von Becherzellen ohne hormonelle Wirkung oder mit einem genau kontrollierten Spiegel von Sexualhormonen zu überwachen. Obwohl sich eine Bindehautepithelzelllinie entwickelt hat21, steht keine Becherzelllinie mit funktioneller Muzinsekretion zur Verfügung. Daher modifizierten wir unsere entwickelte primäre humane CGC-Kultur, um eine Methode zur Analyse des geschlechtsspezifischen Unterschieds in vitrozu etablieren 16 und stellen sie wie folgt dar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung der geschlechtsspezifischen Unterschiede im Augengewebe hilft, die Prozesse von Krankheiten zu verstehen, insbesondere des trockenen Auges und der allergischen Bindehautentzündung, von denen ein Geschlecht überproportional betroffen ist 4,5,6. Auch wenn für diese Studien Tiermodelle verwendet werden können, sind Daten, die direkt aus menschlichem Gewebe gewonnen werden, aufgrund der höchsten Ähnlichkeit mi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wird vom National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D.) finanziert.
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
