במבחנה שיטה לחקר הבדלים מבוססי מין בתאי גביע הלחמית
Summary
מדיום ללא פנול ללא אדום / סרום בקר עוברי הוא אפשרות טובה יותר מאשר RPMI מתקדם לחסל הורמונים אקסוגניים מבלי לשנות את התפקוד הרגיל של תאי גביע הלחמית במחקר של הבדלים מבוססי מין.
Abstract
עין יבשה היא מחלה רב-גורמית המשפיעה על בריאות פני העין, עם שכיחות גבוהה יותר באופן משמעותי אצל נשים. הפרעה של מוצין יוצר ג’ל המופרש על ידי תאי גביע הלחמית (CGCs) על פני השטח של העין תורמת למחלות מרובות של פני השטח של העין. חיסול הורמוני המין האקסוגניים חיוני להשגת תוצאות עקביות במהלך מחקר חוץ גופי של הבדלים מבוססי מין ב- CGCs. מאמר זה מתאר שיטה למזער את נוכחותם של הורמונים אקסוגניים בחקר הבדלים מבוססי מין ב- CGCs תוך שמירה על תפקודם הפיזיולוגי. CGCs מתורמים אנושיים לאחר המוות משני המינים תורבתו מחתיכות של הלחמית בתווך RPMI עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) (המכונה המדיום השלם) עד למפגש. כמעט 48 שעות לפני תחילת הניסויים, CGCs הועברו למדיום RPMI ללא פנול אדום או FBS אך עם 1% BSA (המכונה מדיום נטול פנול-אדום). התפקוד התאי התקין נחקר על ידי מדידת העלייה בגירוי תוך-תאי [Ca 2+] ([Ca2+]i) לאחר גירוי קרבצ’ול (Cch, 1 x 10-4 M) באמצעות מיקרוסקופ fura 2/acetoxymethyl (AM). התוצאה מראה כי CGCs שמרו על תפקוד תקין במדיה נטולת פנול-אדום לאחר 48 שעות. לא נצפה הבדל משמעותי בתגובת [Ca2+]i בין מדיום סל”ד ללא פנול אדום לבין מדיום שלם בגירוי Cch. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתווך RPMI ללא פנול-אדום עם 1% BSA כדי לחסל הורמונים אקסוגניים מבלי לשנות את התפקוד הרגיל של CGCs במחקר של הבדלים מבוססי מין.
Introduction
הבדלים מבוססי מין משפיעים על תהליכים מרובים של משטח העין 1,2,3. הביטוי הקליני של הבדלים מבוססי מין אלה הוא ההבדל בשכיחות של מחלות רבות על פני העין בין גברים לנשים, כגון עין יבשה ודלקת הלחמית 4,5,6. ראיות מצביעות על כך שהבדלים מבוססי מין נובעים מרמות ביולוגיות מרובות, כולל פרופילים שונים של גנים על כרומוזומי X ו- Y7 וההשפעות של הורמונים8. חקר הבסיס המולקולרי של הבדלים מבוססי מין יכול לספק הבנה טובה יותר של מחלות, ובסופו של דבר, לשפר את הרפואה המותאמת אישית.
משטח העין כולל את סרט הדמעות שמעליו, הקרנית והלחמית. הבדלים מבוססי מין נצפים במספר מרכיבים של משטח העין, כולל סרט הדמעות 9,10, קרנית 11, בלוטת הדמעות 12,13, ובלוטות מייבומיאן שגם מפרישות דמעות 12. מחקרים מכניסטיים רבים חקרו את ההשפעה של הורמוני מין על הקרנית ומרכיביה הקשורים14,15; עם זאת, מעט ידוע על ההבדלים מבוססי המין בלחמית ובתאי הגביע שלה. הלחמית היא קרום רירי המכסה את לובן העין ואת פני השטח הפנימיים של העפעף. אפיתל הלחמית מורכב מתאי קשקש לא קרקטיניים, רב-שכבתיים, מרובדים16.
בין תאי הקשקש המרובדים של הלחמית, ישנם תאי גביע (CGCs) המשולבים על פני השטח האפיקליים של האפיתל. תאי גביע אלה מאופיינים במספר רב של גרגרי הפרשה הממוקמים בקוטב האפי17. CGCs מסנתזים ומפרישים את המוצין MUC5AC יוצר הג’ל כדי להעניק לחות למשטח העין ולשמן אותו במהלך מצמוץ17. הפרשת מוצין מווסתת היטב על ידי התוך-תאי [Ca 2+] ([Ca2+]i) וההפעלה של קינאז מווסת אות חוץ-תאי תלוי Ras (ERK1/2)18. חוסר יכולת להפריש מוצין גורם ליובש של פני השטח של העין ו sequelae של הפרעות פתולוגיות. על משטח עיני מודלק, לעומת זאת, הפרשת מוצין נרחבת המגורה על ידי מתווכי דלקת מובילה לתפיסה של דביקות וגירוד של העין19. תנאים אלה עם הפרשת מוצין מופרעת יובילו בסופו של דבר להידרדרות פני העין.
תפקידם של תאי גביע כמקור העיקרי של מוצין עיני מוכר זה מכבר20, עם זאת, ההבדלים מבוססי המין בוויסות המוצין הן במצב פיזיולוגי והן במצב פתולוגי עדיין לא התגלו. מערכת במבחנה תהיה שימושית כדי לפקח על תפקודם של תאי גביע ללא ההשפעה ההורמונלית או עם רמה מבוקרת במדויק של הורמוני מין. למרות שקו תאי אפיתל לחמית התפתח21, אין קו תאי גביע עם הפרשת מוצין פונקציונלית זמינה. לכן, שינינו את תרבות ה-CGC האנושית הראשונית שפיתחנו כדי לבסס שיטה לניתוח ההבדל מבוסס המין במבחנה16, ולהציג אותו להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
חקירת ההבדלים מבוססי המין ברקמות העין מסייעת להבין את תהליכי המחלות, במיוחד עין יבשה ודלקת לחמית אלרגית, המשפיעות באופן לא פרופורציונלי על מין אחד 4,5,6. למרות שניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים עבור מחקרים אלה, נתונים המתקבלים ישירות מרקמה …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה ממומנת על ידי EY019470 המענקים של המכון הלאומי לעיניים (D.A.D).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
