In Vitro (시험관 ) 결막 잔 세포의 성별 기반 차이를 연구하는 방법
Summary
페놀 레드-프리/태아 무혈청 배지는 성별에 따른 차이 연구에서 결막 잔 세포의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 고급 RPMI보다 더 나은 옵션입니다.
Abstract
안구건조증은 안구 표면 건강에 영향을 미치는 여러 요인으로 인한 질환으로, 여성의 유병률이 매우 높습니다. 결막 잔 세포(CGC)가 안구 표면으로 분비하는 겔 형성 점액의 파괴는 여러 안구 표면 질환의 원인이 됩니다. 외인성 성 호르몬의 제거는 CGC의 성별 차이에 대한 시험관 내 연구 중에 일관된 결과를 얻는 데 필수적입니다. 이 논문은 생리적 기능을 유지하면서 CGC의 성별 차이 연구에서 외인성 호르몬의 존재를 최소화하는 방법을 설명합니다. 남녀 모두의 사후 인간 기증자로부터 얻은 CGC는 10% 소 태아 혈청(FBS)(완전 배지라고 함)이 있는 RPMI 배지의 결막 조각에서 합류할 때까지 배양되었습니다. 실험이 시작되기 거의 48시간 전에 CGC를 페놀 레드 또는 FBS가 없지만 1% BSA(페놀-레드-프리 배지라고 함)가 있는 RPMI 배지로 옮겼습니다. 정상적인 세포 기능은 fura 2/acetoxymethyl(AM) 현미경을 사용하여 카르바콜(Cch, 1 x 10-4 M) 자극 후 세포 내 [Ca 2+]([Ca2+]i)의 증가를 측정하여 연구되었습니다. 결과는 CGC가 48시간 후에도 페놀-적색-프리 배지에서 정상적인 기능을 유지했음을 보여줍니다. Cch 자극 시 페놀 적색이 없는 RPMI 배지와 완전 배지 간에 [Ca2+]i 반응의 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. 따라서 성별 차이 연구에서 CGC의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 1% BSA가 함유된 페놀-레드 프리 RPMI 배지를 사용하는 것이 좋습니다.
Introduction
성별에 따른 차이는 안구 표면의 여러 과정에 영향을 미친다 1,2,3. 이러한 성별에 따른 차이의 임상적 양상은 안구건조증 및 결막염과 같은 남성과 여성의 많은 안구 표면 질환의 유병률 차이입니다 4,5,6. 증거에 따르면 성별에 따른 차이는 X 염색체와 Y 염색체7의 유전자 프로필의 상이한 프로필과 호르몬8의 영향을 포함한 여러 생물학적 수준에서 발생한다. 성별에 따른 차이의 분자적 기초를 연구하면 질병에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있으며, 궁극적으로 맞춤형 의학을 개선할 수 있습니다.
안구 표면은 위에 놓인 눈물막, 각막 및 결막으로 구성됩니다. 눈물막(tear film)9,10, 각막(cornea)11, 눈물샘(larimal gland)12,13, 눈물샘(meibomian gland)12을 포함한 안구 표면의 여러 구성 요소에서 성별에 따른 차이가 관찰된다. 수많은 기계론적 연구에서 각막 및 관련 구성 요소에 대한 성 호르몬의 영향을 조사했습니다14,15; 그러나 결막과 결막 세포의 성별에 따른 차이에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 결막은 공막과 눈꺼풀 안쪽 표면을 덮고 있는 점막입니다. 결막의 상피는 각질화되지 않고 다층으로 된 층화된 편평 세포로 구성되어 있다16.
결막의 층화된 편평 세포 중에는 상피의 정점 표면에 산재된 잔 세포(CGC)가 있습니다. 이들 잔 세포는 정점 극(17)에 위치한 많은 수의 분비 과립을 특징으로 한다. CGC는 겔 형성 뮤신 MUC5AC를 합성 및 분비하여 안구 표면에 수분을 공급하고 눈 깜빡임 동안 윤활합니다17. 뮤신 분비는 세포 내 [Ca 2+] ([Ca2+]i)와 Ras 의존성 세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK1/2)의 활성화에 의해 엄격하게 조절됩니다 18. 점액을 분비하지 못하면 안구 표면이 건조해지고 병리학적 이상이 후유증이 생깁니다. 그러나 염증이 있는 안구 표면에서는 염증 매개체에 의해 자극된 광범위한 점액 분비로 인해 눈의 끈적임과 가려움증이 유발된다19. 점액 분비가 방해를 받는 이러한 상태는 결국 안구 표면의 악화로 이어집니다.
안구 점액의 주요 공급원으로서 잔 세포의 역할은 오랫동안 인식되어 왔지만20 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 점액 조절의 성별 차이는 발견되지 않은 상태로 남아 있습니다. 체외 시스템은 호르몬 영향 없이 또는 정밀하게 조절된 수준의 성 호르몬으로 잔 세포의 기능을 모니터링하는 데 유용할 것입니다. 결막 상피 세포주가 발달했음에도 불구하고21 기능성 점액 분비를 가진 잔 세포주는 없습니다. 따라서 개발된 1차 인간 CGC 배양을 수정하여 in vitro16에서 성별에 따른 차이를 분석하는 방법을 확립하고 아래와 같이 제시하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
안구 조직의 성별에 따른 차이를 조사하는 것은 질병, 특히 안구건조증과 알레르기성 결막염의 진행 과정을 이해하는 데 도움이 되며, 이는 한쪽 성별에 불균형적으로 영향을 미친다 4,5,6. 이러한 연구에는 동물 모델을 사용할 수 있지만 생체 내 인간 세포와의 유사성이 가장 높기 때문에 인간 조직에서 직접 얻은 데이?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute) 보조금 EY019470(D.A.D)의 지원을 받습니다.
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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