Fenol rødfritt / føtalt bovint serumfritt medium er et bedre alternativ enn avansert RPMI for å eliminere eksogene hormoner uten å endre den normale funksjonen til konjunktivale begerceller i studiet av kjønnsbaserte forskjeller.
Tørre øyne er en multifaktoriell sykdom som påvirker okulær overflatehelse, med en dypt høyere prevalens hos kvinner. Forstyrrelse av det geldannende slimet som utskilles av konjunktivale begerceller (CGC) på den okulære overflaten bidrar til flere okulære overflatesykdommer. Eliminering av eksogene kjønnshormoner er avgjørende for å oppnå konsistente resultater under in vitro-studier av kjønnsbaserte forskjeller i CGC. Denne artikkelen beskriver en metode for å minimere tilstedeværelsen av eksogene hormoner i studiet av kjønnsbaserte forskjeller i CGC samtidig som deres fysiologiske funksjon opprettholdes. CGC fra post mortem menneskelige donorer av begge kjønn ble dyrket fra biter av bindehinnen i RPMI-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) (referert til som komplett medium) til sammenløp. Nesten 48 timer før starten av forsøkene ble CGC overført til RPMI-medium uten fenolrødt eller FBS, men med 1% BSA (referert til som fenol-rødfritt medium). Den normale cellulære funksjonen ble studert ved å måle økningen i intracellulær [Ca 2+] ([Ca2+]i) etter stimulering av karbachol (Cch, 1 x 10-4 M) ved bruk av fura 2/acetoksymetyl (AM) mikroskopi. Resultatet viser at CGC opprettholdt normal funksjon i fenolfrie medier etter 48 timer. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i [Ca2+]i respons mellom fenol rødfritt RPMI medium og komplett medium ved Cch-stimulering. Derfor anbefaler vi å bruke det fenolrøde frie RPMI-mediet med 1% BSA for å eliminere eksogene hormoner uten å endre den normale funksjonen til CGC i studien av kjønnsbaserte forskjeller.
Kjønnsbaserte forskjeller påvirker flere prosesser på den okulære overflaten 1,2,3. Den kliniske manifestasjonen av disse kjønnsbaserte forskjellene er forskjellen i forekomsten av mange okulære overflatesykdommer mellom menn og kvinner, som tørre øyne og konjunktivitt 4,5,6. Bevis tyder på at kjønnsbaserte forskjeller oppstår fra flere biologiske nivåer, inkludert de forskjellige profilene av gener på X- og Y-kromosomer7 og effekten av hormoner8. Å studere det molekylære grunnlaget for kjønnsbaserte forskjeller kan gi en bedre forståelse av sykdom og til slutt forbedre personlig medisin.
Den okulære overflaten består av den overliggende tårfilmen, hornhinnen og bindehinden. Kjønnsbaserte forskjeller observeres i flere komponenter i den okulære overflaten, inkludert tårefilmen 9,10, hornhinnen 11, lacrimalkjertelen 12,13 og meibomiske kjertler som også utskiller tårer 12. Tallrike mekanistiske studier har undersøkt effekten av kjønnshormoner på hornhinnen og tilhørende komponenter14,15; Imidlertid er lite kjent om de kjønnsbaserte forskjellene i bindehinnen og dens begerceller. Konjunktivene er en slimhinne som dekker scleraen og den indre overflaten av øyelokket. Epitelet i konjunktivene består av ikke-keratiniserende, flerlags, stratifiserte plateepitelceller16.
Blant de stratifiserte plateepitelcellene i konjunktivene er det bobleceller (CGC) spredt på epitelets apikale overflate. Disse boblecellene er preget av det store antallet sekretoriske granulater som ligger ved den apikale polen17. CGC syntetiserer og utskiller det geldannende slimet MUC5AC for å fukte den okulære overflaten og smøre den under blinking17. Mucinsekresjon reguleres tett av den intracellulære [Ca 2+] ([Ca2+]i) og aktiveringen av den Ras-avhengige ekstracellulære signalregulerte kinasen (ERK1/2)18. Manglende evne til å utskille mucin resulterer i tørrhet i den okulære overflaten og følgetilstander av patologiske abnormiteter. På en betent okulær overflate fører imidlertid omfattende slimutskillelse stimulert av inflammatoriske mediatorer til en oppfatning av klebrighet og kløe i øyet19. Disse forholdene med forstyrret mucinsekresjon vil til slutt føre til forringelse av den okulære overflaten.
Rollen til begerceller som den viktigste kilden til okulær mucin, har lenge vært anerkjent20, men de kjønnsbaserte forskjellene i mucinregulering i både fysiologiske og patologiske tilstander forblir uoppdaget. Et in vitro-system ville være nyttig for å overvåke funksjonen av bobleceller uten hormonell effekt eller med et nøyaktig kontrollert nivå av kjønnshormoner. Selv om en konjunktival epitelcellelinje har utviklet21, er det ingen begercellelinje med funksjonell slimutskillelse tilgjengelig. Derfor modifiserte vi vår utviklede primære menneskelige CGC-kultur for å etablere en metode for å analysere den kjønnsbaserte forskjellen in vitro16, og presentere den som nedenfor.
Undersøkelse av kjønnsbaserte forskjeller i okulært vev bidrar til å forstå sykdomsprosessene, spesielt tørre øyne og allergisk konjunktivitt, som uforholdsmessig påvirker ett kjønn 4,5,6. Selv om dyremodeller kan brukes til disse studiene, er data hentet direkte fra humant vev avgjørende på grunn av den høyeste likheten med humane celler in vivo. Konjunktivvevene som brukes i den nåværende eksperimentelle…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet er finansiert av National Eye Institute Grant EY019470 (DAD).
0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |