In vitro Método para Estudo de Diferenças Sexuais em Células Caliciformes Conjuntivais
Summary
O meio livre de vermelho fenol/soro fetal bovino é uma opção melhor do que o RPMI avançado para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das células caliciformes da conjuntiva no estudo de diferenças baseadas no sexo.
Abstract
O olho seco é uma doença multifatorial que afeta a saúde da superfície ocular, com prevalência profundamente maior em mulheres. A ruptura da mucina formadora de gel que é secretada pelas células caliciformes conjuntivais (CGCs) na superfície ocular contribui para múltiplas doenças da superfície ocular. A eliminação de hormônios sexuais exógenos é essencial para a obtenção de resultados consistentes durante o estudo in vitro de diferenças sexuais em CGCs. Este trabalho descreve um método para minimizar a presença de hormônios exógenos no estudo de diferenças baseadas no sexo em CGCs, mantendo sua função fisiológica. CGCs de doadores humanos post-mortem de ambos os sexos foram cultivados a partir de pedaços da conjuntiva em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino (SFB) (referido como meio completo) até a confluência. Cerca de 48 h antes do início dos experimentos, as CGCs foram transferidas para o meio RPMI sem vermelho de fenol ou SFB, mas com BSA a 1% (referido como meio livre de vermelho fenol). A função celular normal foi estudada medindo-se o aumento da [Ca 2+] ([Ca 2+]i) intracelular após estimulação com carbacol (Cch, 1 x 10-4 M) usando microscopia de fura 2/acetoximetil (AM). O resultado mostra que os CGCs mantiveram função normal no meio livre de fenol após 48 h. Nenhuma diferença significativa na resposta [Ca2+]i foi observada entre o meio RPMI livre de fenol vermelho e o meio completo após estimulação com Cch. Portanto, recomendamos o uso do meio RPMI livre de vermelho fenol com BSA a 1% para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das CGCs no estudo de diferenças baseadas no sexo.
Introduction
Diferenças baseadas no sexo afetam múltiplos processos da superfície ocular 1,2,3. A manifestação clínica dessas diferenças baseadas no sexo é a diferença na prevalência de muitas doenças da superfície ocular entre homens e mulheres, como olho seco e conjuntivite4,5,6. Evidências sugerem que as diferenças baseadas no sexo surgem de múltiplos níveis biológicos, incluindo os diferentes perfis de genes nos cromossomos X e Y7 e os efeitos dos hormônios8. Estudar a base molecular das diferenças baseadas no sexo pode fornecer uma melhor compreensão da doença e, eventualmente, melhorar a medicina personalizada.
A superfície ocular compreende o filme lacrimal sobrejacente, córnea e conjuntiva. Diferenças baseadas no sexo são observadas em múltiplos componentes da superfície ocular, incluindo o filme lacrimal 9,10, a córnea 11, a glândula lacrimal 12,13 e as glândulas meibomianas que também secretam lágrimas 12. Numerosos estudos mecanísticos têm investigado o efeito dos hormônios sexuais sobre a córnea e seus componentes associados14,15; no entanto, pouco se sabe sobre as diferenças baseadas no sexo na conjuntiva e suas células caliciformes. A conjuntiva é uma membrana mucosa que cobre a esclera e a superfície interna da pálpebra. O epitélio da conjuntiva é composto por células escamosas estratificadas, não queratinizantes, multicamadas16.
Dentre as células escamosas estratificadas da conjuntiva, encontram-se as células caliciformes (CGCs) intercaladas na superfície apical do epitélio. Essas células caliciformes caracterizam-se pelo grande número de grânulos secretores localizados no polo apical17. Os CGCs sintetizam e secretam a mucina formadora de gel MUC5AC para hidratar a superfície ocular e lubrificá-la durante o piscar17. A secreção de mucina é fortemente regulada pela [Ca 2+] intracelular ([Ca2+]i) e pela ativação da quinase regulada por sinal extracelular dependente de Ras (ERK1/2)18. A incapacidade de secretar mucina resulta em ressecamento da superfície ocular e sequelas de anormalidades patológicas. Em uma superfície ocular inflamada, entretanto, a extensa secreção de mucina estimulada por mediadores inflamatórios leva à percepção de aderência e coceira ocular19. Essas condições com secreção perturbada de mucina acabarão levando à deterioração da superfície ocular.
O papel das células caliciformes como a principal fonte de mucina ocular tem sido reconhecidohá muito tempo20, no entanto, as diferenças baseadas no sexo na regulação da mucina em ambos os estados fisiológicos e patológicos permanecem desconhecidas. Um sistema in vitro seria útil para monitorar a função das células caliciformes sem o efeito hormonal ou com um nível precisamente controlado de hormônios sexuais. Embora uma linhagem celular epitelial conjuntival tenha se desenvolvido21, não há linhagem de células caliciformes com secreção funcional de mucina disponível. Portanto, modificamos nossa cultura primária de CGC humana desenvolvida para estabelecer um método para analisar a diferença baseada em sexo in vitro16, e apresentá-la como abaixo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A investigação das diferenças sexuais nos tecidos oculares ajuda a compreender os processos das doenças, especialmente o olho seco e a conjuntivite alérgica, que afetam desproporcionalmente um sexo 4,5,6. Embora modelos animais possam ser utilizados para esses estudos, dados obtidos diretamente do tecido humano são essenciais devido à maior similaridade com as células humanas in vivo. Os tecidos conjuntivais uti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho é financiado pelo National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
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