In Vitro Konjonktival Goblet Hücrelerinde Cinsiyete Dayalı Farklılıkları İnceleme Yöntemi
Summary
Fenol kırmızısı içermeyen/fetal sığır serumu içermeyen ortam, cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde konjonktival goblet hücrelerinin normal işlevini değiştirmeden eksojen hormonları ortadan kaldırmak için gelişmiş RPMI’den daha iyi bir seçenektir.
Abstract
Kuru göz, oküler yüzey sağlığını etkileyen çok faktörlü bir hastalıktır ve kadınlarda görülme sıklığı çok yüksektir. Konjonktival goblet hücreleri (CGC’ler) tarafından oküler yüzeye salgılanan jel oluşturan müsinin bozulması, çoklu oküler yüzey hastalıklarına katkıda bulunur. Ekzojen seks hormonlarının eliminasyonu, CGC’lerdeki cinsiyete dayalı farklılıkların in vitro çalışması sırasında tutarlı sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bu makale, fizyolojik işlevlerini korurken CGC’lerdeki cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde eksojen hormonların varlığını en aza indirmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Her iki cinsiyetten postmortem insan donörlerinden alınan CGC’ler, RPMI ortamındaki konjonktiva parçalarından% 10 fetal sığır serumu (FBS) (tam ortam olarak adlandırılır) ile birleşene kadar kültürlendi. Deneylerin başlamasından yaklaşık 48 saat önce, CGC’ler fenol kırmızısı veya FBS olmadan,% 1 BSA (fenol-kırmızı içermeyen ortam olarak adlandırılır) ile RPMI ortamına aktarıldı. Normal hücresel fonksiyon, fura 2 / asetoksimetil () mikroskobu kullanılarak karbakol (Cch, 1 x 10-4 M) stimülasyonundan sonra hücre içi [Ca 2+] ([Ca2 +] i) artışı ölçülerek incelenmiştir. Sonuç, CGC’lerin 48 saat sonra fenol kırmızısı içermeyen ortamda normal işlevini sürdürdüğünü göstermektedir. Cch stimülasyonu üzerine fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı ile tam ortam arasında [Ca2+] i yanıtında anlamlı bir fark gözlenmedi. Bu nedenle, cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde CGC’lerin normal işlevini değiştirmeden eksojen hormonları ortadan kaldırmak için% 1 BSA ile fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamının kullanılmasını öneririz.
Introduction
Cinsiyete dayalı farklılıklar oküler yüzeyin çoklu süreçlerini etkiler 1,2,3. Bu cinsiyete dayalı farklılıkların klinik tezahürü, kuru göz ve konjonktivit gibi birçok oküler yüzey hastalığının erkekler ve kadınlar arasındaki prevalansındaki farklılıktır 4,5,6. Kanıtlar, cinsiyete dayalı farklılıkların, X ve Y kromozomları7 üzerindeki farklı gen profilleri ve hormonların8 etkileri dahil olmak üzere çoklu biyolojik seviyelerden kaynaklandığını göstermektedir. Cinsiyete dayalı farklılıkların moleküler temelini incelemek, hastalığın daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir ve nihayetinde kişiselleştirilmiş tıbbı geliştirebilir.
Oküler yüzey, üstteki gözyaşı filmi, kornea ve konjonktivadan oluşur. Gözyaşı filmi 9,10, kornea11, gözyaşı bezi 12,13 ve gözyaşı salgılayan meibomian bezleri 12 dahil olmak üzere oküler yüzeyin birçok bileşeninde cinsiyete dayalı farklılıklar gözlenir. Çok sayıda mekanik çalışma, seks hormonlarının kornea ve ilişkili bileşenleri üzerindeki etkisini araştırmıştır14,15; Bununla birlikte, konjonktiva ve kadeh hücrelerindeki cinsiyete dayalı farklılıklar hakkında çok az şey bilinmektedir. Konjonktiva, sklerayı ve göz kapağının iç yüzeyini kaplayan bir mukoza zarıdır. Konjonktiva epiteli, keratinize olmayan, çok katmanlı, tabakalı skuamöz hücrelerdenoluşur 16.
Konjonktivanın tabakalı skuamöz hücreleri arasında, epitelin apikal yüzeyine serpiştirilmiş goblet hücreleri (CGC’ler) vardır. Bu goblet hücreleri, apikal kutup17’de bulunan çok sayıda salgı granülü ile karakterize edilir. CGC’ler, oküler yüzeyi nemlendirmek ve yanıp sönme sırasında yağlamak için jel oluşturan müsin MUC5AC’yi sentezler ve salgılar17. Müsin sekresyonu, hücre içi [Ca 2 +] ([Ca 2+] i) ve Ras’a bağımlı hücre dışı sinyal regüle kinazın (ERK1 /2) aktivasyonu tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir18. Müsin salgılanamaması, oküler yüzeyin kuruluğuna ve patolojik anormalliklerin sekellerine neden olur. Bununla birlikte, iltihaplı bir oküler yüzeyde, enflamatuar mediatörler tarafından uyarılan geniş müsin salgısı, gözün yapışkanlığı ve kaşıntısı algısına yol açar19. Müsin salgısının bozulduğu bu koşullar sonunda oküler yüzeyin bozulmasına yol açacaktır.
Goblet hücrelerinin oküler müsinin ana kaynağı olarak rolü uzun zamandır bilinmektedir20, ancak hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda müsin regülasyonundaki cinsiyete dayalı farklılıklar keşfedilmemiştir. Bir in vitro sistem, kadeh hücrelerinin işlevini hormonal etki olmadan veya hassas bir şekilde kontrol edilen bir seks hormonu seviyesiyle izlemek için yararlı olacaktır. Konjonktival epitel hücre hattı21 gelişmiş olmasına rağmen, fonksiyonel müsin sekresyonu olan goblet hücre hattı mevcut değildir. Bu nedenle, in vitro16’da cinsiyete dayalı farkı analiz etmek için bir yöntem oluşturmak için geliştirdiğimiz birincil insan CGC kültürümüzü değiştirdik ve aşağıdaki gibi sunduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oküler dokulardaki cinsiyete dayalı farklılıkların araştırılması, bir cinsiyeti orantısız bir şekilde etkileyen hastalıkların, özellikle kuru göz ve alerjik konjonktivitin süreçlerini anlamaya yardımcı olur 4,5,6. Bu çalışmalar için hayvan modelleri kullanılabilse de, doğrudan insan dokusundan elde edilen veriler, in vivo insan hücrelerine en yüksek benzerlik nedeniyle önemlidir. Mevcut dene…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü Hibe EY019470 (DAM) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
References
- Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
- Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
- Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
- Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians’ Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
- Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
- Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
- Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3 (2020).
- Yang, J. -. H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
- Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
- Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
- Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
- Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
- Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
- Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
- Suzuki, T., et al. Estrogen’s and progesterone’s impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
- Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
- Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
- Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
- Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
- Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
- García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220 (2022).
- Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
- García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
- Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
- Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
- Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
- Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
- Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305 (2022).
