الهندسة المجهرية 3D الكولاجين الهلاميات المائية مع محاذاة الألياف طويلة المدى
Summary
يوضح هذا البروتوكول استخدام قناة الموائع الدقيقة مع تغيير الهندسة على طول اتجاه تدفق السوائل لتوليد إجهاد ممتد (تمتد) لمحاذاة الألياف في هيدروجيل الكولاجين ثلاثي الأبعاد (سمك <250 ميكرومتر). تمتد المحاذاة الناتجة عبر عدة ملليمترات وتتأثر بمعدل الإجهاد الممتد.
Abstract
توجه ألياف الكولاجين I (COL1) المحاذاة حركة الخلايا السرطانية ، وتؤثر على مورفولوجيا الخلايا البطانية ، وتتحكم في تمايز الخلايا الجذعية ، وهي سمة مميزة لأنسجة القلب والعضلات والعظام. لدراسة استجابة الخلايا للبيئات الدقيقة المحاذاة في المختبر ، تم تطوير العديد من البروتوكولات لتوليد مصفوفات COL1 مع محاذاة الألياف المحددة ، بما في ذلك الطرق المغناطيسية والميكانيكية والقائمة على الخلايا والموائع الدقيقة. من بين هذه الأساليب ، توفر مناهج الموائع الدقيقة قدرات متقدمة مثل التحكم الدقيق في تدفقات السوائل والبيئة المكروية الخلوية. ومع ذلك ، فإن مناهج الموائع الدقيقة لتوليد مصفوفات COL1 المحاذاة لمنصات الزراعة المتقدمة في المختبر قد اقتصرت على “الحصير” الرقيقة (<40 ميكرومتر في السماكة) من ألياف COL1 التي تمتد على مسافات أقل من 500 ميكرومتر ولا تفضي إلى تطبيقات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. هنا ، نقدم بروتوكولا لتصنيع مصفوفات 3D COL1 (بسمك 130-250 ميكرومتر) مع مناطق مقياس ملليمتر من محاذاة الألياف المحددة في جهاز الموائع الدقيقة. توفر هذه المنصة قدرات متقدمة لزراعة الخلايا لنمذجة البيئات الدقيقة للأنسجة المهيكلة من خلال توفير الوصول المباشر إلى المصفوفة المهندسة الدقيقة لزراعة الخلايا.
Introduction
توجد الخلايا في شبكة ليفية ثلاثية الأبعاد معقدة تسمى المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، ويتكون الجزء الأكبر منها من الكولاجين البروتيني الهيكلي من النوع الأول (COL1) 1,2. توفر الخصائص الفيزيائية الحيوية ل ECM إشارات إرشادية للخلايا ، واستجابة لذلك ، تعيد الخلايا تشكيل العمارة الدقيقة ECM3،4،5. يمكن أن تؤدي هذه التفاعلات المتبادلة بين مصفوفة الخلايا إلى محاذاة مجالات ألياف COL16 التي تعزز تكوين الأوعية الدموية وغزو الخلايا في بيئة الورم7،8،9 وتؤثر على مورفولوجيا الخلية 10،11،12 ، الاستقطاب 13 ، والتمايز 14. تعمل ألياف الكولاجين المحاذاة أيضا على تعزيز التئام الجروح 15 ، وتلعب دورا رئيسيا في نمو الأنسجة16 ، وتساهم في اتصال الخلايا بعيد المدى17,18. لذلك ، يعد تكرار البنية الدقيقة لألياف COL1 الأصلية في المختبر خطوة مهمة نحو تطوير نماذج منظمة لدراسة استجابات الخلايا للبيئات الدقيقة المحاذاة.
تم إنشاء أنظمة زراعة خلايا الموائع الدقيقة كتقنية مفضلة لتطوير أنظمة الفيزيولوجيا الدقيقة (MPS) 19،20،21،22،23. من خلال الاستفادة من تأثيرات التحجيم المجهرية المواتية ، توفر هذه الأنظمة تحكما دقيقا في تدفقات السوائل ، وتدعم الإدخال المتحكم فيه للقوى الميكانيكية ، وتحدد البيئة المكروية الكيميائية الحيوية داخل قناة دقيقة21،24،25،26،27. تم استخدام منصات MPS لنمذجة البيئات الدقيقة الخاصة بالأنسجة ودراسة التفاعلات متعددة الأعضاء28. في الوقت نفسه ، تم استكشاف الهلاميات المائية على نطاق واسع لتلخيص ميكانيكا 3D والتأثير البيولوجي ل ECM التي لوحظت في الجسم الحي29,30. مع التركيز المتزايد على دمج ثقافة 3D مع منصات الموائع الدقيقة ، يمكن للعديد من الأساليب الجمع بين الهلاميات المائية COL1 في أجهزة الموائع الدقيقة31،32،33. ومع ذلك ، فقد اقتصرت طرق محاذاة الهلاميات المائية COL1 في قنوات الموائع الدقيقة على “حصائر” 2D رقيقة (سمك < 40 ميكرومتر) في قنوات بعرض <1 مم ، مما يوفر إمكانات محدودة لنمذجة استجابات الخلايا في البيئات الدقيقة ثلاثية الأبعادالمحاذاة 31،34،35،36.
لتحقيق الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد COL1 المحاذاة في نظام الموائع الدقيقة ، فقد ثبت أنه عندما يتعرض محلول COL1 ذاتي التجميع لتدفقات التمديد المحلية (تغير السرعة على طول الاتجاه الانسيابي) ، تعرض الهلاميات المائية COL1 الناتجة درجة من محاذاة الألياف تتناسب طرديا مع حجم معدل الإجهاد الممتد الذي يواجهونه37 ، 38. تصميم microchannel في هذا البروتوكول فريد من نوعه بطريقتين. أولا ، يقدم التصميم المجزأ إجهادا محليا ممتدا لحل COL1 ، وثانيا ، يسمح بنائه “المكون من قطعتين” للمستخدم بمحاذاة ألياف COL1 ثم تفكيك القناة للوصول مباشرة إلى الألياف المحاذاة بتنسيق مفتوح. يمكن اعتماد هذا النهج أيضا لتطوير منصات الموائع الدقيقة المعيارية التي تطور أنظمة فسيولوجية دقيقة مع مصفوفات COL1 مرتبة. يصف البروتوكول التالي عملية تصنيع القنوات الدقيقة المجزأة ويفصل استخدام القنوات لمحاذاة الأبقار atelo COL1. يوفر هذا البروتوكول أيضا تعليمات لزراعة الخلايا على COL1 بتنسيق بئر مفتوح ويناقش إضافة وظائف إلى النظام الأساسي باستخدام طبقة قاعدة مغناطيسية معيارية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم وصف بروتوكولات توليد مصفوفات COL1 مع الألياف المحاذاة باستخدام الطرق المغناطيسية ، والتطبيق المباشر للإجهاد الميكانيكي ، وتقنيات الموائع الدقيقة47. تستخدم مناهج الموائع الدقيقة بشكل شائع لإنشاء أنظمة فسيولوجية دقيقة بسبب خصائص التدفق والنقل المحددة جيدا ، والتي تتيح التح?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني للصحة بموجب رقم الجائزة R21GM143658 ومن قبل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم 2150798. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية لوكالات التمويل.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
- Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
- Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
- Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
- Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
- Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
- Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
- Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
- Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
- Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
- Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
- Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
- Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
- Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
- Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
- Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
- Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
- Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
- Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
- Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
- Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
- Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
- Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
- Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
- Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).
