लंबी दूरी के फाइबर संरेखण के साथ माइक्रोइंजीनियरिंग 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल
Summary
यह प्रोटोकॉल 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल (मोटाई में <250 μm) में फाइबर को संरेखित करने के लिए विस्तारात्मक तनाव (स्ट्रेचिंग) उत्पन्न करने के लिए द्रव प्रवाह दिशा के साथ ज्यामिति को बदलने के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के उपयोग को प्रदर्शित करता है। परिणामी संरेखण कई मिलीमीटर में फैला हुआ है और विस्तारात्मक तनाव दर से प्रभावित होता है।
Abstract
संरेखित कोलेजन I (COL1) फाइबर ट्यूमर सेल गतिशीलता का मार्गदर्शन करते हैं, एंडोथेलियल सेल आकृति विज्ञान को प्रभावित करते हैं, स्टेम सेल भेदभाव को नियंत्रित करते हैं, और हृदय और मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों की एक पहचान हैं। विट्रो में संरेखित माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए, चुंबकीय, यांत्रिक, सेल-आधारित और माइक्रोफ्लुइडिक विधियों सहित परिभाषित फाइबर संरेखण के साथ सीओएल 1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। इनमें से, माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण उन्नत क्षमताओं की पेशकश करते हैं जैसे द्रव प्रवाह और सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट पर सटीक नियंत्रण। हालांकि, उन्नत इन विट्रो कल्चर प्लेटफार्मों के लिए संरेखित सीओएल 1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण सीओएल 1 फाइबर के पतले “मैट” (<40 μm मोटाई) तक सीमित हैं जो 500 μm से कम दूरी तक फैले हुए हैं और 3 डी सेल कल्चर अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं हैं। यहां, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में परिभाषित फाइबर संरेखण के मिलीमीटर-स्केल क्षेत्रों के साथ 3 डी सीओएल 1 मैट्रिसेस (मोटाई में 130-250 μm) बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह मंच सेल संस्कृति के लिए माइक्रो-इंजीनियर मैट्रिक्स तक सीधी पहुंच प्रदान करके संरचित ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करने के लिए उन्नत सेल कल्चर क्षमताएं प्रदान करता है।
Introduction
कोशिकाएं एक जटिल 3 डी रेशेदार नेटवर्क में रहती हैं जिसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कहा जाता है, जिसका बड़ा हिस्सा संरचनात्मक प्रोटीन कोलेजन प्रकार I (COL1)1,2 से बना होता है। ईसीएम के बायोफिज़िकल गुण कोशिकाओं को मार्गदर्शन संकेत प्रदान करते हैं, और जवाब में, कोशिकाएं ईसीएम माइक्रोआर्किटेक्चर 3,4,5 को फिर से तैयार करती हैं। ये पारस्परिक सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन संरेखित सीओएल 1 फाइबर डोमेन6 को जन्म दे सकते हैं जो ट्यूमर वातावरण 7,8,9 में एंजियोजेनेसिस और सेल आक्रमण को बढ़ावा देते हैं और सेल आकृति विज्ञान10,11,12, ध्रुवीकरण13 और भेदभाव 14 को प्रभावित करते हैं। संरेखित कोलेजन फाइबर घाव भरने को भी बढ़ावा देते हैं15, ऊतक विकास16 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और लंबी दूरी के सेल संचार17,18 में योगदान करते हैं। इसलिए, इन विट्रो में देशी COL1 फाइबर माइक्रोआर्किटेक्चर की प्रतिकृति बनाना संरेखित माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए संरचित मॉडल विकसित करने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है।
माइक्रोफिज़ियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) 19,20,21,22,23 विकसित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर सिस्टम को एक पसंदीदा तकनीक के रूप में स्थापित किया गया है। अनुकूल माइक्रोस्केल स्केलिंग प्रभावों का लाभ उठाते हुए, ये प्रणालियां द्रव प्रवाह पर सटीक नियंत्रण प्रदान करती हैं, यांत्रिक बलों के नियंत्रित परिचय का समर्थन करती हैं, और माइक्रोचैनल21,24,25,26,27 के भीतर जैव रासायनिक माइक्रोएन्वायरमेंट को परिभाषित करती हैं। एमपीएस प्लेटफार्मों का उपयोग ऊतक-विशिष्ट माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करने और बहु-अंग इंटरैक्शन का अध्ययन करनेके लिए किया गया है। इसके साथ ही, विवो29,30 में देखे गए ईसीएम के 3 डी यांत्रिकी और जैविक प्रभाव को पुन: उत्पन्न करने के लिए हाइड्रोगेल का व्यापक रूप से पता लगाया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों के साथ 3 डी संस्कृति को एकीकृत करने पर बढ़ते जोर के साथ, कई दृष्टिकोण माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों31,32,33 में सीओएल 1 हाइड्रोगेल को जोड़ सकते हैं। हालांकि, माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में COL1 हाइड्रोगेल को संरेखित करने के तरीके <1 मिमी चौड़े चैनलों में पतले 2D "मैट" (<40 μm मोटाई) तक सीमित हैं, जो संरेखित 3D माइक्रोएन्वायरमेंट 31,34,35,36 में मॉडल सेल प्रतिक्रियाओं की सीमित क्षमता प्रदान करते हैं।
माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में संरेखित 3 डी सीओएल 1 हाइड्रोगेल प्राप्त करने के लिए, यह दिखाया गया है कि, जब एक स्व-संयोजन सीओएल 1 समाधान स्थानीय विस्तार प्रवाह (धारावार दिशा के साथ वेग परिवर्तन) के संपर्क में आता है, तो परिणामस्वरूप सीओएल 1 हाइड्रोगेल फाइबर संरेखण की एक डिग्री प्रदर्शित करते हैं जो सीधेविस्तारक तनाव दर के परिमाण के आनुपातिक होता है जो वे अनुभव करते हैं। 38. इस प्रोटोकॉल में माइक्रोचैनल डिजाइन दो मायनों में अद्वितीय है; सबसे पहले, खंडित डिजाइन COL1 समाधान के लिए स्थानीय विस्तारात्मक तनाव का परिचय देता है, और दूसरा, इसका “दो-टुकड़ा” निर्माण उपयोगकर्ता को COL1 फाइबर को संरेखित करने की अनुमति देता है और फिर एक खुले प्रारूप में सीधे संरेखित फाइबर तक पहुंचने के लिए चैनल को अलग करता है। इस दृष्टिकोण को मॉड्यूलर माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों को विकसित करने के लिए अपनाया जा सकता है जो आदेशित सीओएल 1 मैट्रिसेस के साथ माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम विकसित करते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल खंडित माइक्रोचैनलबनाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है और गोजातीय एटेलो सीओएल 1 को संरेखित करने के लिए चैनलों के उपयोग का विवरण देता है। यह प्रोटोकॉल एक खुले कुएं प्रारूप में COL1 पर कोशिकाओं की खेती के लिए निर्देश भी प्रदान करता है और मॉड्यूलर, चुंबकीय आधार परत का उपयोग करके प्लेटफ़ॉर्म में कार्यक्षमता जोड़ने पर चर्चा करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संरेखित तंतुओं के साथ COL1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के प्रोटोकॉल को चुंबकीय विधियों, यांत्रिक तनाव के प्रत्यक्ष अनुप्रयोग और माइक्रोफ्लुइडिकतकनीकों का उपयोग करके वर्णित किया गया है। माइक्रोफ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को पुरस्कार संख्या R21GM143658 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और अनुदान संख्या 2150798 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि फंडिंग एजेंसियों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
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