Microengenharia 3D Colágeno Hidrogéis com Alinhamento de Fibras de Longo Alcance

Summary

Este protocolo demonstra o uso de um canal microfluídico com geometria variável ao longo da direção do fluxo de fluido para gerar deformação extensional (alongamento) para alinhar as fibras em um hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espessura). O alinhamento resultante se estende por vários milímetros e é influenciado pela taxa de deformação extensional.

Abstract

As fibras alinhadas de colágeno I (COL1) guiam a motilidade das células tumorais, influenciam a morfologia das células endoteliais, controlam a diferenciação das células-tronco e são uma marca registrada dos tecidos cardíaco e musculoesquelético. Para estudar a resposta celular a microambientes alinhados in vitro, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar matrizes de COL1 com alinhamento de fibras definido, incluindo métodos magnéticos, mecânicos, baseados em células e microfluídicos. Destas, as abordagens microfluídicas oferecem recursos avançados, como controle preciso sobre os fluxos de fluidos e o microambiente celular. No entanto, as abordagens microfluídicas para gerar matrizes alinhadas de COL1 para plataformas avançadas de cultura in vitro têm sido limitadas a “esteiras” finas (<40 μm de espessura) de fibras de COL1 que se estendem por distâncias inferiores a 500 μm e não são propícias a aplicações de cultura celular 3D. Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar matrizes 3D de COL1 (130-250 μm de espessura) com regiões de alinhamento de fibras definidas em escala milimétrica em um dispositivo microfluídico. Esta plataforma fornece recursos avançados de cultura de células para modelar microambientes de tecidos estruturados, fornecendo acesso direto à matriz micro-projetada para cultura de células.

Introduction

As células residem em uma complexa rede fibrosa 3D denominada matriz extracelular (MEC), cuja maior parte é composta pela proteína estrutural colágeno tipo I (COL1)^1,2. As propriedades biofísicas da MEC fornecem pistas de orientação às células e, em resposta, as células remodelam a microarquitetura da MEC ^3,4,5. Essas interações recíprocas célula-matriz podem dar origem a domínios alinhados das fibras COL1⁶ que promovem angiogênese e invasão celular no ambiente tumoral ^7,8,9 e influenciam a morfologia celular 10,11,12^, polarização¹³ e diferenciação ¹⁴. As fibras colágenas alinhadas também promovem a cicatrização de^feridas15, desempenham papel fundamental no desenvolvimento tecidual 16 e contribuem para a comunicação celular de longo alcance^17,18. Portanto, replicar a microarquitetura da fibra COL1 nativa in vitro é um passo importante para o desenvolvimento de modelos estruturados para estudar as respostas celulares a microambientes alinhados.

Sistemas de cultura de células microfluídicas têm se estabelecido como tecnologia preferencial para o desenvolvimento de sistemas microfisiológicos (MPS)19,20,21,22,23. Aproveitando os efeitos favoráveis de escala em microescala, esses sistemas fornecem controle preciso sobre os fluxos de fluidos, suportam a introdução controlada de forças mecânicas e definem o microambiente bioquímico dentro de um microcanal 21,24,25,26,27. As plataformas MPS têm sido utilizadas para modelar microambientes tecido-específicos e estudar interações multi-órgãos²⁸. Simultaneamente, hidrogéis têm sido amplamente explorados para recapitular a mecânica 3D e a influência biológica da MEC que são observadas in vivo^29,30. Com uma ênfase crescente na integração da cultura 3D com plataformas microfluídicas, inúmeras abordagens podem combinar hidrogéis de COL1 em dispositivos microfluídicos^31,32,33. No entanto, os métodos para alinhar hidrogéis de COL1 em canais microfluídicos têm sido limitados a “esteiras” 2D finas (<40 μm de espessura) em canais <1 mm de largura, oferecendo potencial limitado para modelar respostas celulares em microambientes 3D alinhados^31,34,35,36.

Para obter hidrogéis 3D de COL1 alinhados em um sistema microfluídico, foi demonstrado que, quando uma solução de COL1 automontável é exposta a fluxos extensionais locais (mudança de velocidade ao longo da direção do fluxo), os hidrogéis COL1 resultantes exibem um grau de alinhamento da fibra que é diretamente proporcional à magnitude da taxa de deformação extensional que experimentam^{37, 38º}. O design de microcanais neste protocolo é único de duas maneiras; primeiro, o projeto segmentado introduz a tensão extensional local para a solução COL1 e, segundo, sua construção de “duas peças” permite que o usuário alinhe as fibras COL1 e, em seguida, desmonte o canal para acessar diretamente as fibras alinhadas em um formato aberto. Esta abordagem pode ainda ser adotada para o desenvolvimento de plataformas microfluídicas modulares que desenvolvam sistemas microfisiológicos com matrizes de COL1 ordenadas. O protocolo a seguir descreve o processo de fabricação de microcanais segmentados e detalha o uso dos canais para alinhar o ATEL bovino COL1. Este protocolo também fornece instruções para o cultivo de células em COL1 em um formato de poço aberto e discute a adição de funcionalidade à plataforma usando uma camada de base magnética modular.

Protocol

1. Fabricação do canal de duas peças e da base da plataforma modular NOTA: O canal microfluídico é construído usando duas partes — o “recorte” do canal microfluídico, que é cortado a partir de uma folha de polidimetil siloxano (PDMS) de espessura definida, e a tampa do canal, que se liga reversivelmente ao recorte e forma o canal. O canal é circundado por uma estrutura de poli(metacrilato de metila) (PMMA) que atuará como um reservatório de meio (<strong class="xfig…

Representative Results

Quando uma solução de COL1 automontável flui através de um canal com área de secção transversal decrescente, a velocidade de fluxo (v x) da solução de COL1 aumenta localmente em uma magnitude, ∂v x, ao longo do comprimento da constrição entre os dois segmentos (∂x), resultando em uma taxa de deformação extensional (ε̇) onde ε̇ = ∂v x/∂x. A taxa de deformação extensional pode ser calculada a partir da velocidade do fluido, que é medida por meio da velocimetria p…

Discussion

Protocolos para geração de matrizes de COL1 com fibras alinhadas têm sido descritos utilizando métodos magnéticos, aplicação direta de deformações mecânicas e técnicas^{microfluídicas47}. Abordagens microfluídicas são comumente usadas para criar sistemas microfisiológicos devido às suas características de fluxo e transporte bem definidas, que permitem o controle preciso sobre o microambiente bioquímico. Uma vez que as fibras de COL1 alinhadas fornecem pistas instrutivas importantes …

Materials

(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)	Sigma Aldrich	440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip	Jensen Global	JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet	KJ Magnetics	D31
3M (TC) 12X12-6-467MP	DigiKey	3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%	Signa Aldrich	179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER	Electro-Technic Products	12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar	VWR	AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested	VWR	45000-666
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CT-FIRE software	LOCI – University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL	Lonza	CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL	VWR	VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50	Graphtec	CE LITE-50
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer	McMaster-Carr	87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells	Thermo Fisher Scientific	C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T10282
Isopropanol	Fisher Scientific	A4154
Laser cutter	Full Spectrum	20×12 H-series
Microfluidics Syringe pump	New Era Syringe Pumps	NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E	Gilson	FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen	Advanced BioMatrix	5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4	VWR	70011044.00
PBS pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100	Alfa Aesar	J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20	USCUTTER	GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip	Restek	22766.00
Silicon wafer	University wafer	452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g	VWR	BDH9292-500G
Sylgard 184	VWR	102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352.00