Этот протокол демонстрирует использование микрофлюидного канала с изменяющейся геометрией вдоль направления потока жидкости для создания растяжения (растяжения) для выравнивания волокон в 3D-гидрогеле коллагена (толщина <250 мкм). Результирующее выравнивание простирается на несколько миллиметров и зависит от скорости деформации растяжения.
Выровненные волокна коллагена I (COL1) управляют подвижностью опухолевых клеток, влияют на морфологию эндотелиальных клеток, контролируют дифференцировку стволовых клеток и являются отличительной чертой тканей сердца и опорно-двигательного аппарата. Для изучения реакции клеток на выровненные микроокружения in vitro было разработано несколько протоколов для создания матриц COL1 с определенным выравниванием волокон, включая магнитные, механические, клеточные и микрофлюидные методы. Из них микрофлюидные подходы предлагают расширенные возможности, такие как точный контроль потоков жидкости и клеточного микроокружения. Однако микрофлюидные подходы к созданию выровненных матриц COL1 для передовых платформ культивирования in vitro были ограничены тонкими «матами» (толщиной <40 мкм) волокон COL1, которые простираются на расстояния менее 500 мкм и не способствуют применению 3D-клеточных культур. Здесь мы представляем протокол для изготовления 3D-матриц COL1 (толщиной 130-250 мкм) с областями миллиметрового масштаба с определенным выравниванием волокон в микрофлюидном устройстве. Эта платформа предоставляет расширенные возможности клеточных культур для моделирования структурированных микроокружений тканей, предоставляя прямой доступ к микроинженерной матрице для клеточной культуры.
Клетки находятся в сложной 3D-волокнистой сети, называемой внеклеточным матриксом (ECM), основная часть которой состоит из структурного белка коллагена I типа (COL1)1,2. Биофизические свойства ECM обеспечивают направляющие сигналы клеткам, и в ответ клетки реконструируют микроархитектуру ECM 3,4,5. Эти взаимные взаимодействия между клетками и матрицами могут приводить к образованию выровненных волоконных доменов6 COL1, которые способствуют ангиогенезу и клеточной инвазии в опухолевой среде 7,8,9 и влияют на морфологию клеток 10,11,12, поляризацию 13 и дифференцировку 14. Выровненные коллагеновые волокна также способствуют заживлению ран 15, играют ключевую роль в развитии тканей 16 и способствуют межклеточной коммуникации на большом расстоянии17,18. Таким образом, репликация нативной микроархитектуры волокна COL1 in vitro является важным шагом на пути к разработке структурированных моделей для изучения реакции клеток на выровненные микросреды.
Микрофлюидные системы клеточных культур были установлены в качестве предпочтительной технологии для разработки микрофизиологических систем (MPS)19,20,21,22,23. Используя благоприятные микромасштабные эффекты масштабирования, эти системы обеспечивают точный контроль над потоками жидкости, поддерживают контролируемое введение механических сил и определяют биохимическое микроокружение в микроканале 21,24,25,26,27. Платформы МПС использовались для моделирования тканеспецифических микросред и изучения межорганных взаимодействий28. В то же время гидрогели были широко исследованы для повторения 3D-механики и биологического влияния ECM, которые наблюдаются in vivo29,30. С растущим акцентом на интеграцию 3D-культуры с микрофлюидными платформами многочисленные подходы могут комбинировать гидрогели COL1 в микрофлюидных устройствах31,32,33. Однако методы выравнивания гидрогелей COL1 в микрофлюидных каналах были ограничены тонкими 2D-«матами» (толщиной <40 мкм) в каналах шириной <1 мм, что дает ограниченный потенциал для моделирования клеточных реакций в выровненных 3D-микросредах31,34,35,36.
Для достижения выровненных 3D-гидрогелей COL1 в микрофлюидной системе было показано, что, когда самоорганизующийся раствор COL1 подвергается воздействию локальных экстенсиональных потоков (изменение скорости вдоль направления потока), полученные гидрогели COL1 демонстрируют степень выравнивания волокон, которая прямо пропорциональна величине скорости растяжения, которую они испытывают37, 38. Конструкция микроканала в этом протоколе уникальна по двум причинам; во-первых, сегментированная конструкция вносит локальную растяжительную деформацию в решение COL1, а во-вторых, его «двухкомпонентная» конструкция позволяет пользователю выровнять волокна COL1, а затем разобрать канал для прямого доступа к выровненным волокнам в открытом формате. Этот подход может быть в дальнейшем использован для разработки модульных микрофлюидных платформ, которые разрабатывают микрофизиологические системы с упорядоченными матрицами COL1. Следующий протокол описывает процесс изготовления сегментированных микроканалов и подробно описывает использование каналов для выравнивания коровьего атело COL1. Этот протокол также содержит инструкции по культивированию клеток на COL1 в формате открытой скважины и обсуждает добавление функциональности к платформе с использованием модульного магнитного базового слоя.
Протоколы генерации матриц COL1 с выровненными волокнами были описаны с использованием магнитных методов, прямого применения механической деформации и микрофлюидных методов47. Микрофлюидные подходы обычно используются для создания микрофизиологических систем из-за их че?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения под номером R21GM143658 и Национальным научным фондом под номером 2150798. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения финансирующих агентств.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
Silicon wafer | University wafer | 452 | |
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |