Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance
Summary
Este protocolo demuestra el uso de un canal microfluídico con geometría cambiante a lo largo de la dirección del flujo de fluido para generar tensión extensional (estiramiento) para alinear fibras en un hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espesor). La alineación resultante se extiende a lo largo de varios milímetros y está influenciada por la velocidad de deformación extensional.
Abstract
Las fibras alineadas de colágeno I (COL1) guían la motilidad de las células tumorales, influyen en la morfología de las células endoteliales, controlan la diferenciación de las células madre y son un sello distintivo de los tejidos cardíacos y musculoesqueléticos. Para estudiar la respuesta celular a microambientes alineados in vitro, se han desarrollado varios protocolos para generar matrices COL1 con alineación de fibra definida, incluidos métodos magnéticos, mecánicos, basados en células y microfluídicos. De estos, los enfoques microfluídicos ofrecen capacidades avanzadas, como un control preciso sobre los flujos de fluidos y el microambiente celular. Sin embargo, los enfoques microfluídicos para generar matrices COL1 alineadas para plataformas avanzadas de cultivo in vitro se han limitado a “esteras” delgadas (<40 μm de espesor) de fibras COL1 que se extienden a distancias inferiores a 500 μm y no son propicias para aplicaciones de cultivo celular 3D. Aquí, presentamos un protocolo para fabricar matrices 3D COL1 (130-250 μm de espesor) con regiones de escala milimétrica de alineación de fibra definida en un dispositivo microfluídico. Esta plataforma proporciona capacidades avanzadas de cultivo celular para modelar microambientes de tejidos estructurados al proporcionar acceso directo a la matriz de microingeniería para el cultivo celular.
Introduction
Las células residen en una compleja red fibrosa 3D llamada matriz extracelular (MEC), la mayor parte de la cual está compuesta por la proteína estructural colágeno tipo I (COL1)1,2. Las propiedades biofísicas de la ECM proporcionan señales de orientación a las células y, en respuesta, las células remodelan la microarquitectura de la ECM 3,4,5. Estas interacciones recíprocas célula-matriz pueden dar lugar a dominios de fibra COL1 alineados6 que promueven la angiogénesis y la invasión celular en el ambiente tumoral 7,8,9 e influyen en la morfología celular 10,11,12, polarización13 y diferenciación 14. Las fibras de colágeno alineadas también promueven la cicatrización de heridas 15, desempeñan un papel clave en el desarrollo de los tejidos16 y contribuyen a la comunicación celular de largo alcance17,18. Por lo tanto, replicar la microarquitectura de fibra COL1 nativa in vitro es un paso importante hacia el desarrollo de modelos estructurados para estudiar las respuestas celulares a microambientes alineados.
Los sistemas de cultivo celular microfluídico se han establecido como una tecnología preferida para desarrollar sistemas microfisiológicos (MPS)19,20,21,22,23. Aprovechando los efectos favorables de escala a microescala, estos sistemas proporcionan un control preciso sobre los flujos de fluidos, admiten la introducción controlada de fuerzas mecánicas y definen el microambiente bioquímico dentro de un microcanal 21,24,25,26,27. Las plataformas MPS se han utilizado para modelar microambientes específicos de tejidos y estudiar interacciones multiorgánicas28. Simultáneamente, los hidrogeles han sido ampliamente explorados para recapitular la mecánica 3D y la influencia biológica de la ECM que se observan in vivo29,30. Con un énfasis creciente en la integración del cultivo 3D con plataformas microfluídicas, numerosos enfoques pueden combinar hidrogeles COL1 en dispositivos microfluídicos31,32,33. Sin embargo, los métodos para alinear hidrogeles COL1 en canales microfluídicos se han limitado a “esteras” delgadas 2D (<40 μm de espesor) en canales de <1 mm de ancho, ofreciendo un potencial limitado para modelar respuestas celulares en microambientes 3D alineados31,34,35,36.
Para lograr hidrogeles COL1 3D alineados en un sistema microfluídico, se ha demostrado que, cuando una solución de COL1 autoensamblable se expone a flujos extensionales locales (cambio de velocidad a lo largo de la dirección de la corriente), los hidrogeles COL1 resultantes muestran un grado de alineación de la fibra que es directamente proporcional a la magnitud de la velocidad de deformación extensional que experimentan37, 38. El diseño de microcanales en este protocolo es único en dos sentidos; primero, el diseño segmentado introduce tensión extensional local a la solución COL1, y segundo, su construcción de “dos piezas” permite al usuario alinear las fibras COL1 y luego desmontar el canal para acceder directamente a las fibras alineadas en un formato abierto. Este enfoque se puede adoptar para desarrollar plataformas microfluídicas modulares que desarrollen sistemas microfisiológicos con matrices COL1 ordenadas. El siguiente protocolo describe el proceso de fabricación de microcanales segmentados y detalla el uso de los canales para alinear el atelo bovino COL1. Este protocolo también proporciona instrucciones para cultivar células en COL1 en un formato de pozo abierto y discute la adición de funcionalidad a la plataforma utilizando una capa base magnética modular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos para generar matrices COL1 con fibras alineadas han sido descritos utilizando métodos magnéticos, la aplicación directa de deformación mecánica y técnicas microfluídicas47. Los enfoques microfluídicos se utilizan comúnmente para crear sistemas microfisiológicos debido a sus características de flujo y transporte bien definidas, que permiten un control preciso sobre el microambiente bioquímico. Dado que las fibras COL1 alineadas proporcionan señales instructivas clave dur…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud bajo el número de concesión R21GM143658 y por la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención 2150798. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de las agencias de financiación.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
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