Infrarød termografi for påvisning av endringer i brunt fettvevsaktivitet

Summary

Her presenterer vi en protokoll for måling av fettvevsaktivitet etter et måltid hos mennesker og forsøksdyr.

Abstract

Måling av brunt fettvev (BAT) aktivitet ved positronemisjonstomografi computertomografi (PET-CT) via akkumulering av ¹⁸F-fluorodeoksyglukose (FDG) etter et måltid eller hos overvektige eller diabetespasienter mislykkes som valgt metode. Hovedårsaken er at ¹⁸F-FDG konkurrerer med den postprandial høye glukoseplasmakonsentrasjonen for den samme glukosetransportøren på membranen til BAT-celler. I tillegg bruker BAT fettsyrer som energikilde også, noe som ikke er synlig med PET-CT og kan endres sammen med glukosekonsentrasjonen hos overvektige og diabetespasienter. Derfor, for å estimere den fysiologiske betydningen av BAT hos dyr og mennesker, brukes en ny infrarød termografimetode som brukes i nyere publikasjoner.

Etter faste over natten ble BAT-aktivitet målt ved infrarød termografi før og etter et måltid hos frivillige mennesker og hunnmus av villtype. Kameraprogramvaren beregner objektets temperatur ved hjelp av avstand fra objektet, hudemissivitet, reflektert romtemperatur, lufttemperatur og relativ fuktighet. Hos mus var det barberte området over BAT et område av interesse for hvilke gjennomsnittlige og maksimale temperaturer ble målt. Fasen av brunstsyklusen hos hunnmus ble bestemt etter et eksperiment med vaginale utstryk farget med cresylfiolett (0,1%) flekkløsning. Hos friske frivillige ble to hudområder i nakken valgt: det supraklavikulære området (over kragebeinet, hvor BAT-celler er tilstede) og det interklavikulære området (mellom kragebenene, hvor det ikke oppdages BAT-vev). BAT-aktivitet bestemmes av subtraksjonen av disse to verdiene. Også gjennomsnittlige og maksimale temperaturer på hudområder kan bestemmes hos dyr og mennesker.

Endringer i BAT-aktivitet etter et måltid målt ved infrarød termografi, en ikke-invasiv og mer sensitiv metode, ble vist å være kjønn, alder og fase av brunstsyklusen avhengig av laboratoriedyr. Som en del av diettindusert termogenese ble BAT-aktivering hos mennesker også vist seg å være avhengig av kjønn, alder og kroppsmasseindeks. Videre bestemmelse av patofysiologiske endringer i BAT-aktivitet etter et måltid vil være av stor betydning for deltakere med høye glukoseplasmakonsentrasjoner (fedme og diabetes mellitus type 2), samt hos forskjellige laboratoriedyr (knock-out mus). Denne metoden er også et variabelt verktøy for å bestemme mulige aktiverende legemidler som kan forynge BAT-aktivitet.

Introduction

Brunt fettvev (BAT), i motsetning til hvitt fettvev (WAT), lagrer ikke, men bruker heller energi. Ved sympatisk stimulering bruker BAT fettsyrer og glukose og produserer varme ved aktivering av frakoblingsprotein 1 (UCP1). Funksjonen til UCP1 er å bruke en H ⁺ gradient mellom to mitokondrielle membraner for å produsere varme i stedet for ATP. Funksjonen til BAT er å øke varmeproduksjonen under kalde forhold, noe som fører til en økning i energiforbruket¹. Etter kald eksponering hemmer sensoriske innganger fra huden varmfølsomme nevroner i median preoptisk (MnPO) kjernen i det hypotalamiske preoptiske området (POA), noe som reduserer den hemmende effekten av POA-nevroner på rostral raphe pallidus (rRPa). Aktiveringen av rRPa-nevroner øker sympatisk aktivitet, som etterfølges av en økning i BAT-aktivitet ^2,3. Kuldeindusert BAT-aktivering forbedrer insulinfølsomheten hos mennesker⁴, og denne aktiviteten reduseres hos mennesker med økt kroppsmasseindeks (BMI) og alder 1,5,6,7.

Bortsett fra sin rolle i kuldeindusert termogenese, etter et måltid, øker glukoseopptaket i BAT i den magre mannlige befolkningen, noe som bidrar til diettindusert termogenese (DIT), som er høyere hos BAT-positive mannlige personer ^8,9. Den toppmoderne teknikken som brukes til å måle BAT-aktivitet er positronutslippstomografi computertomografi, kjent som PET-CT. Denne metoden bestemmer BAT-aktiviteten ved å måle akkumuleringen av radiotracer fluorodeoksyglukose (¹⁸F-FDG). Imidlertid mislykkes PET-CT som den valgte metoden for å oppdage aktivering av BAT etter et måltid. En av grunnene er at ¹⁸F-FDG etter et måltid konkurrerer med postprandial hyperglykemi for den samme glukosetransportøren, noe som gjør den uegnet til å bestemme BAT-aktivering etter et måltid, spesielt når man sammenligner BAT-aktivitet hos friske og diabetiske deltakere med mulige forskjeller i blodsukkerkonsentrasjoner. Videre bruker BAT fettsyrer som energikilde for varmeproduksjon som ikke er synlig med PET-CT. ¹⁸ F-FDG-akkumulering i BAT etter et måltid er knapt synlig¹⁰ og tolkes derfor som et negativt resultat i de fleste tilfeller. Ikke overraskende ble det nylig foreslått at aktiveringen av BAT er mer uttalt i den menneskelige befolkningen enn vi tidligere hadde trodd; Derfor er en ny tilnærming for å oppdage BAT-aktivitet og dens involvering i metabolske forstyrrelser nødvendig⁷. Et forsøk på å løse dette problemet er å måle volumet av BAT med magnetisk resonansavbildning (MR) hos prediabetespasienter og pasienter med diabetes mellitus type 2 (T2DM) med insulinresistens¹¹. BAT-volum målt ved MR er imidlertid ikke en tilstrekkelig indikator for å estimere daglig funksjon og bruk av glukose og fettsyrer ved BAT. Derfor, for å estimere reelle forskjeller i BAT-aktivitet hos friske versus T2DM-pasienter, er det nødvendig med en ny tilnærming som gir en mulighet til å finne ut den patologiske mekanismen for BAT-funksjonsfeil hos T2DM-pasienter.

For å bestemme aktiveringen av BAT, utførte vi målinger av BAT-varmeproduksjon før og etter et måltid ved hjelp av infrarød (IR) termografi (figur 1) ^12,13. Etablering av IR-termografi som en metode for å måle BAT-aktivitet etter et måltid hos friske og overvektige personer eller pasienter med diabetes mellitus vil ha stor innvirkning på feltet. Den dag i dag brukes IR-termografi til bestemmelse av kuldeindusert aktivering av BAT^13,14,15. I nyere menneskelig historie er kuldeindusert BAT-aktivitet ikke veldig uttalt lenger (på grunn av riktig oppvarming av habitater, riktig klær), mens BAT-aktivering etter et måltid skjer hver dag. Videre er den fysiologiske reguleringen av disse to BAT-funksjonene via hypothalamus helt forskjellig. Etter et måltid fører aktiveringen av proopiomelanocortin (POMC)-uttrykkende nevroner i den hypotalamiske bueformede kjernen (Arc) til en økning i sympatisk nerveaktivitet via rRPa¹⁶. Kuldeindusert aktivering av BAT målt ved IR-termografi eller PET-CT er feil når det brukes som et mål for daglig BAT-aktivitet. Økt BAT-aktivitet etter et måltid etterfølges av glukoseutnyttelse, noe som til syvende og sist er viktig for å opprettholde glukosehomeostase, insulinfølsomhet og daglig regulering av glukosekonsentrasjon. Postprandial BAT-aktivering fører til en økning i postprandial glukoseforbruk, etterfulgt av en økning i varmeproduksjon og kroppstemperatur (DIT). Dette ble vist å være kjønn, alder og BMI-avhengig¹². Lignende kjønnsforskjeller i BAT-aktivering etter et måltid er observert hos mannlige og kvinnelige laboratoriemus¹⁷. Disse funnene samsvarer med nylig oppdagede kjønnsforskjeller i reguleringen av BAT av Burke et al., som viste at hypotalamisk regulering av BAT-via en underpopulasjon av POMC-nevroner er forskjellig hos mannlige og kvinnelige mus¹⁸. Den postprandial aktiveringen av BAT er mindre hos kvinner, eldre befolkninger og overvektige mennesker. Mangelen på BAT-aktivering etter et måltid (redusert glukoseutnyttelse) kan føre til en høyere forekomst av nedsatt glukosetoleranse hos kvinner 19,20,21,22. Dessverre ble flertallet av studier på BAT-aktivering bare gjort på menn. Ved å aktivere BAT etter et måltid, øker glukoseopptaket i den magre mannlige befolkningen. Det er ikke overraskende at DIT etter BAT-aktivering er høyere hos BAT-positive mannlige personer ^8,9. Videre forbedrer BAT-transplantasjon hos hannmus glukosetoleransen, øker insulinfølsomheten og reduserer kroppsvekt og fettmasse²³.

PET-CT mislykkes som en metode for valg for måling av BAT-aktivitet, spesielt etter et måltid. Derfor ble det utviklet en ikke-invasiv og mer sensitiv metode. IR-termografi gjør det mulig å estimere BAT-aktivitet hos forskjellige laboratoriedyr (utslagsmus), så vel som menneskelige deltakere, uavhengig av kjønn, alder eller effekten av forskjellige patologiske forhold på BAT-aktivitet. En ekstra fordel med denne metoden er enkelheten for deltakere og forsøksdyr, noe som gjør at vi kan estimere de potensielle fordelene med BAT-boosterterapi. De nylige studiene som bruker IR-termografi for å bestemme den fysiologiske oppførselen til BAT etter kald eksponering eller et måltid, er beskrevet i den nylige publikasjonen av Brasil et ^al.24.

Protocol

Alle forsøksprosedyrer på forsøksdyr ble godkjent av Nasjonal etisk komité og Landbruksdepartementet (EP 185/2018). Forsøkene ble utført i samsvar med den etiske kodeksen til The Croatian Society for Laboratory Animal Science og ARRIVE retningslinjer. Alle prosedyrer utført i studier som involverte menneskelige deltakere var i samsvar med Helsinkideklarasjonen og godkjent av etikkomiteen ved Universitetet i Zagreb, School of Medicine (UP / I-322-01 / 18-01/56). I denne studien presenterer vi resultatene fra tre kv…

Representative Results

Den enkleste måten å bestemme BAT-aktivitet på er å trekke den maksimale hudtemperaturen over BAT før og etter et måltid hos mennesker. En bedre måte å beregne BAT-aktivitet på er å velge to regioner av interesse: hudområdet over BAT, som ligger i det supraklavikulære området, og det interklavikulære området av huden der det ikke finnes BAT-vev hos mennesker, utpekt som referanseområde (i henhold til PET-CT; Figur 1). BAT-aktivitet bestemmes da lett av subtraksjonen av disse …

Discussion

Nylige studier presenterer økende bevis om fysiologisk regulering og betydning av BAT-aktivitet hos voksne mennesker og dyr i utviklingen av fedme og diabetes mellitus. Videre blir mulig BAT-aktivering av eksogene aktivatorer et mål for farmasøytiske selskaper. For å kunne estimere den fysiologiske reguleringen og patofysiologiske betydningen av BAT i svært belastende sykdommer, samt oppdage en potensiell terapeutisk tilnærming, blir infrarød termografi den foretrukne metoden. Selv om IR-teknologien fremstår som …

Materials

0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020