Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique

Arundhati Das; Debojyoti Das; Amaresh C. Panda

doi:10.3791/64464

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Article de méthode

Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique

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DOI :

10.3791/64464

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16 septembre 2022

Arundhati Das^*¹^,² , Debojyoti Das^*¹^,² , Amaresh C. Panda¹

¹Institute of Life Sciences, ²School of Biotechnology, KIIT University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la méthode détaillée de PCR par gouttelettes numériques (dd-PCR) pour une quantification précise des niveaux d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules à l’aide d’amorces divergentes.

Résumé

La réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase (dd-PCR) est l’une des méthodes de quantification les plus sensibles; il fractionne la réaction en près de 20 000 gouttelettes d’eau dans l’huile, et la PCR se produit dans les gouttelettes individuelles. La dd-PCR présente plusieurs avantages par rapport à la qPCR conventionnelle en temps réel, notamment une précision accrue dans la détection des cibles de faible abondance, l’omission des gènes de référence pour la quantification, l’élimination des réplications techniques pour les échantillons et la démonstration d’une grande résilience aux inhibiteurs dans les échantillons. Récemment, la dd-PCR est devenue l’une des méthodes les plus populaires pour quantifier avec précision l’ADN ou l’ARN cible pour l’analyse de l’expression génique et le diagnostic. Les ARN circulaires (circRNA) sont une grande famille de molécules d’ARN fermées par covalence récemment découvertes dépourvues d’extrémités 5' et 3'. Il a été démontré qu’ils régulent l’expression des gènes en agissant comme des éponges pour les protéines de liaison à l’ARN et les microARN. De plus, les circRNA sont sécrétés dans les fluides corporels et leur résistance aux exonucléases en fait des biomarqueurs pour le diagnostic des maladies. Cet article vise à montrer comment effectuer la conception d’amorces divergentes, l’extraction d’ARN, la synthèse de l’ADNc et l’analyse dd-PCR pour quantifier avec précision les niveaux spécifiques d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules. En conclusion, nous démontrons la quantification précise des circRNA à l’aide de la dd-PCR.

Introduction

Les progrès récents dans les technologies de séquençage de l’ARN et de nouveaux algorithmes de calcul ont permis de découvrir un nouveau membre de la famille croissante des ARN non codants, appelé ARN circulaire (circRNA)¹. Comme leur nom l’indique, les circRNA sont une famille de molécules d’ARN simple brin sans extrémités libres. Ils sont formés par épissage tête à queue non canonique appelé épissage arrière, où le site accepteur d’épissage en amont se joint de manière covalente avec le site donneur d’épissage en aval pour former un cercle d’ARN stable ^1,2. Ce processus pourrait être ....