Трансляционные ортотопические модели мультиформной глиобластомы

Summary

Здесь мы описываем доклиническую ортотопическую модель мыши для GBM, созданную путем внутричерепной инъекции клеток, полученных из генетически модифицированных опухолей мыши. Эта модель отображает признаки заболевания ГБМ человека. Для трансляционных исследований опухоль головного мозга мыши отслеживается с помощью МРТ in vivo и гистопатологии.

Abstract

Генетически модифицированные мышиные модели (GEM) для мультиформной глиобластомы человека (GBM) имеют решающее значение для понимания развития и прогрессирования опухолей головного мозга. В отличие от опухолей ксенотрансплантата, в ГЭУ опухоли возникают в нативном микроокружении у иммунокомпетентной мыши. Тем не менее, использование GBM GEM в доклинических исследованиях лечения является сложной задачей из-за длительных латентных периодов опухоли, гетерогенности частоты новообразований и сроков развития опухоли поздней степени. Мыши, индуцированные с помощью внутричерепной ортотопической инъекции, более пригодны для доклинических исследований и сохраняют черты опухолей GEM. Мы создали ортотопическую модель опухоли головного мозга, полученную из модели GEM с аберрациями Rb, Kras и p53 (TRP), в которой развиваются опухоли GBM, демонстрирующие линейные очаги некроза опухолевыми клетками и плотную васкуляризацию, аналогичную GBM человека. Клетки, полученные из опухолей GEM GBM, вводят внутричерепно мышам-реципиентам дикого типа, соответствующим штамму, и воспроизводят опухоли IV степени, таким образом, обходя длительный латентный период опухоли у мышей GEM и позволяя создавать большие и воспроизводимые когорты для доклинических исследований. Высокопролиферативные, инвазивные и сосудистые особенности модели TRP GEM для GBM повторяются в ортотопических опухолях, а гистопатологические маркеры отражают подгруппы GBM человека. Рост опухоли контролируется серийными МРТ-сканированиями. Из-за инвазивного характера внутричерепных опухолей в иммунокомпетентных моделях тщательное следование описанной здесь процедуре инъекции имеет важное значение для предотвращения роста экстракраниальной опухоли.

Introduction

Глиобластома (GBM; глиома IV степени) является наиболее распространенной и злокачественной опухолью головного мозга, и современные методы лечения неэффективны, что приводит к средней выживаемости 15 месяцев¹. Надежные и точные доклинические модели, представляющие сложные сигнальные пути, участвующие в росте и патогенезе опухоли головного мозга, необходимы для ускорения прогресса в оценке новых терапевтических схем для ГБМ. Мышиные модели, в которых линии опухолевых клеток головного мозга человека имплантируются подкожно мышам с ослабленным иммунитетом, не отражают нативную иммунную среду опухолей головного мозга и не могут быть использованы для оценки способности терапевтических средств пересекать гематоэнцефалический барьер². В идеале доклинические мышиные модели должны также точно воспроизводить гистопатологию GBM человека, включая высокий уровень инвазивности в окружающей паренхиме³. Хотя генетически модифицированные модели мышей (GEM) развивают опухоли в контексте интактной иммунной системы, часто требуются сложные схемы разведения, и опухоли могут развиваться медленно и непоследовательно⁴. Модели аллотрансплантатов, полученные из GEM, лучше подходят для доклинических терапевтических исследований, где требуются большие когорты мышей с опухолями в более короткие сроки.

В предыдущем отчете мы описали ортотопическую модель мыши GBM, полученную непосредственно из опухолей GEM. Онкогенез в GEM инициируется генетическими событиями в клеточных популяциях (в первую очередь астроцитах), экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), которые приводят к прогрессированию до GBM. Эти TRP GEM содержат трансген TgGZT121 (T), который экспрессирует T121 после воздействия рекомбиназы Cre, управляемой GFAP. Экспрессия белка T121 приводит к подавлению активности белка Rb (Rb1, p107 и p103). Совместная экспрессия трансгена Cre, управляемого GFAP (GFAP-CreERT2), нацелена на экспрессию во взрослые астроциты после индукции тамоксифеном. Мыши TRP также являются носителями Cre-зависимого мутанта Kras (Kras^G12D; R) аллель, представляющий собой активацию рецепторного тирозинкиназного пути, и гетерозиготны по потере Pten (P) ^5,6. Одновременные аберрации генов в цепях рецепторной тирозинкиназы (RTK), PI3K и RB участвуют в 74% патогенеза GBM⁷. Таким образом, первичные сигнальные пути, измененные в GBM человека, представлены сконструированными мутациями у мышей TRP, в частности опухолями GBM, в которых активируются общие последующие мишени RTK⁵.

Сингенная ортотопическая модель, полученная из GEM, была проверена как модель, которая повторяет особенности опухолей головного мозга человека, включая инвазивность и наличие биомаркеров подтипа, для использования в качестве платформы для оценки терапии рака, нацеленной на аберрантные пути в GBM. Клетки культивировали из опухолей, собранных из мозга TRP, и повторно имплантировали в мозг мышей, соответствующих штамму, с использованием стереотаксического оборудования для внутричерепной инъекции в кору. В этой доклинической ортотопической мышиной модели были разработаны опухоли GBM, которые были высококлеточными, инвазивными, плеоморфными с высокой частотой митоза и демонстрировали линейные очаги некроза опухолевыми клетками и плотной васкуляризацией, как это наблюдалось для GBM человека. Объемы и рост опухоли измеряли с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) in vivo .

В этом отчете мы описываем оптимальную технику внутричерепной инъекции первичных клеток GBM или клеточных линий в мозг мыши дикого типа, используя опухоли TRP в качестве примера. Тот же протокол может быть адаптирован для мышей с ослабленным иммунитетом и других клеточных линий GBM. Даны важные советы, позволяющие избежать распространенных ошибок, таких как неоптимальная подготовка клеток или утечка клеток в месте инъекции, а также правильное использование стереотаксического оборудования для обеспечения воспроизводимости и надежности модели. В трансляционных целях мы валидируем модель с помощью МРТ-обнаружения роста опухоли головного мозга у живых животных, гистологической характеристики и представляем пример лечения у мышей с опухолями.

Protocol

Протокол исследования, описанный здесь, был одобрен NCI в Комитете по уходу за животными и их использованию Фредерика. NCI-Frederick аккредитован AAALAC International и следует Политике службы общественного здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию. Уход за животными осущ?…

Representative Results

Мышей, которым вводили опухолевые клетки головного мозга, следует ежедневно контролировать на наличие признаков роста опухоли, таких как судороги, атаксия или потеря веса. Рост опухоли головного мозга также можно контролировать с помощью МРТ-сканирования через регулярные промежутки ?…

Discussion

Доклинические модели необходимы для оценки новых терапевтических мишеней и новых стратегий лечения при ГБМ. Генетически модифицированные мышиные модели для GBM имеют преимущество возникновения опухоли в автохтонном участке, но часто с длительной латентностью и непредсказуемым росто?…

Materials

5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T