दीर्घकालिक और अल्पकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल के लिए अलगाव विधि
Summary
हम होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके दीर्घकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एलटी-एचएससी) और अल्पकालिक एचएससी (एसटी-एचएससी) के अलगाव के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
स्व-नवीकरण क्षमता और बहु-वंश भेदभाव क्षमता को आमतौर पर हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) की परिभाषित विशेषताओं के रूप में माना जाता है। हालांकि, कई अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि एचएससी डिब्बे में कार्यात्मक विषमता मौजूद है। हाल के एकल-सेल विश्लेषणों ने एचएससी डिब्बे के भीतर विभिन्न सेल भाग्य के साथ एचएससी क्लोन की सूचना दी है, जिन्हें पक्षपाती एचएससी क्लोन के रूप में जाना जाता है। विषम या खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के अंतर्निहित तंत्र को बहुत कम समझा जाता है, विशेष रूप से आत्म-नवीकरण की लंबाई के बारे में जब शुद्ध एचएससी अंशों को पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा प्रत्यारोपित किया जाता है। इसलिए, दीर्घकालिक एचएससी (एलटी-एचएससी) और अल्पकालिक एचएससी (एसटी-एचएससी) के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव विधि स्थापित करना, उनके आत्म-नवीकरण की लंबाई से परिभाषित, इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए महत्वपूर्ण है। निष्पक्ष बहु-चरण स्क्रीनिंग का उपयोग करते हुए, हमने एक प्रतिलेखन कारक, होक्सबी 5 की पहचान की, जो माउस हेमटोपोइएटिक सिस्टम में एलटी-एचएससी का एक विशेष मार्कर हो सकता है। इस खोज के आधार पर, हमने एक होक्सबी 5 रिपोर्टर माउस लाइन स्थापित की और सफलतापूर्वक एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी को अलग किया। यहां हम होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह अलगाव विधि शोधकर्ताओं को एचएससी डिब्बे में इस तरह की विषमता के लिए आत्म-नवीकरण और जैविक आधार के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद करेगी।
Introduction
हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी), जिनके पास आत्म-नवीकरण क्षमता और बहुशक्ति है, हेमटोपोइएटिक पदानुक्रम 1,2 के शीर्ष पर रहते हैं। 1988 में, वीसमैन और सहयोगियों ने पहली बार प्रदर्शित किया कि फ्लो साइटोमेट्री3 का उपयोग करके माउस एचएससी का अलगाव हासिल किया जा सकता है। इसके बाद, सेल सतह मार्करों के संयोजन द्वारा परिभाषित एक अंश, वंश-सी-किट + एससीए –1 + सीडी 150 + सीडी 34 −/ लोएफएलके 2−, चूहों में सभी एचएससी 4,5,6,7,8 होने की सूचना दी गई थी।
इम्यूनोफेनोटाइपिक रूप से परिभाषित (वंश-सी-किट + एससीए –1 + सीडी 150 + सीडी 34−/ लोएफएलके 2−) एचएससी (इसके बाद, पीएचएससी) को पहले कार्यात्मक रूप से सजातीय माना जाता था। हालांकि, हाल ही में एकल-सेल विश्लेषण से पता चला है कि पीएचएससी अभी भी अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता 9,10 और बहुशक्ति11,12 के संबंध में विषमता प्रदर्शित करते हैं। विशेष रूप से, उनकी आत्म-नवीकरण क्षमता के संबंध में पीएचएससी अंश में दो आबादी मौजूद प्रतीत होती है: दीर्घकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एलटी-एचएससी), जिनमें निरंतर आत्म-नवीकरण क्षमता होती है, और अल्पकालिक हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एसटी-एचएससी), जिनमें क्षणिक आत्म-नवीकरण क्षमता 9,10 होती है।
आज तक, एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी को अलग करने वाले आत्म-नवीकरण क्षमता के आणविक तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है। दोनों सेल आबादी को उनकी आत्म-नवीकरण क्षमताओं के आधार पर अलग करना और अंतर्निहित आणविक तंत्र की खोज करना महत्वपूर्ण है। एलटी-एचएससी13,14,15 को शुद्ध करने के लिए कई रिपोर्टर सिस्टम भी पेश किए गए हैं; हालांकि, प्रत्येक रिपोर्टर सिस्टम द्वारा परिभाषित एलटी-एचएससी शुद्धता परिवर्तनशील है, और अनन्य एलटी-एचएससी शुद्धिकरण आज तक हासिल नहीं किया गया है।
इसलिए, एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी के लिए एक अलगाव प्रणाली विकसित करने से पीएचएससी अंश में आत्म-नवीकरण क्षमता के बारे में अनुसंधान में तेजी आएगी। एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी के अलगाव में, बहु-चरण, निष्पक्ष स्क्रीनिंग का उपयोग करके एक अध्ययन ने एक एकल जीन, होक्सबी 5 की पहचान की, जो पीएचएससी अंश16 में विषम रूप से व्यक्त किया गया है। इसके अतिरिक्त, होक्सबी 5 रिपोर्टर चूहों के अस्थि मज्जा विश्लेषण से पता चला है कि पीएचएससी अंश के लगभग 20% -25% में होक्सबी 5 पीओएस कोशिकाएं होती हैं। होक्सबी 5पॉस पीएचएससी और होक्सबी 5 नेग पीएचएससी का उपयोग करके एक प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण परख से पता चला है कि केवल होक्सबी 5पॉस पीएचएससी में दीर्घकालिक आत्म-नवीकरण क्षमता होती है, जबकि होक्सबी 5नेग पीएचएससी एक छोटी अवधि के भीतर अपनी आत्म-नवीकरण क्षमता खो देते हैं, यह दर्शाता है कि होक्सबी 5 पीएचएससी अंश16 में एलटी-एचएससी की पहचान करता है।
यहां, हम होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, हम Hoxb5pos / neg pHSCs की आत्म-नवीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए एक प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण परख प्रस्तुत करते हैं (चित्रा 1)। यह होक्सबी 5 रिपोर्टर सिस्टम हमें एलटी-एचएससी और एसटी-एचएससी को भावी प्रभाव से अलग करने की अनुमति देता है और एलटी-एचएससी-विशिष्ट विशेषताओं की समझ में योगदान देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
परंपरागत रूप से, सेल सतह मार्कर-परिभाषित एचएससी को एचएससी के कार्यों का अध्ययन करने के लिए तैयार किया गया है, जैसे कि आत्म-नवीकरण क्षमता और बहु-शक्ति 19,20,21। हालांकि, इम्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जानवरों की देखभाल के लिए और रिकेन बीडीआर में प्राप्तकर्ता चूहों के साथ-साथ कोबे विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला प्रबंधन के लिए हितोमी ओगा, कायोको नागासाका और मासाकी मियाहाशी प्रदान करने के लिए कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं। लेखक भी इस काम के लिए चल रहे समर्थन की बहुत सराहना करते हैं। मसानोरी मियानिशी को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) काकेन्ही ग्रांट नंबर जेपी 17के07407 और जेपी 20एच03268, मोचिदा मेमोरियल फाउंडेशन फॉर मेडिकल एंड फार्मास्यूटिकल रिसर्च, द लाइफ साइंस फाउंडेशन ऑफ जापान, द टाकेडा साइंस फाउंडेशन, द एस्टेलस फाउंडेशन फॉर रिसर्च ऑन मेटाबोलिक डिसऑर्डर, और एएमईडी-प्राइम, एएमईडी द्वारा अनुदान संख्या जेपी 18 जीएम 6110020 के तहत समर्थित किया गया था। तारो साकमकी JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP21K20669 और JP22K16334 द्वारा समर्थित है और द्वारा समर्थित था जेएसपीएस कोर-टू-कोर प्रोग्राम और रिकेन जूनियर रिसर्च एसोसिएट प्रोग्राम। कात्सुयुकी निशि को जेएसपीएस ग्रांट नंबर काकेन्ही जेपी 18 जे 13408 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
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