Summary

Isoleringsmetod för långsiktiga och kortvariga hematopoetiska stamceller

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Vi presenterar ett steg-för-steg-protokoll för isolering av långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC) och kortvariga HSC (ST-HSC) med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet.

Abstract

Självförnyelsekapacitet och differentieringspotential för flera linjer betraktas allmänt som de definierande egenskaperna hos hematopoetiska stamceller (HSC). Många studier har dock föreslagit att funktionell heterogenitet finns i HSC-facket. Nya encellsanalyser har rapporterat HSC-kloner med olika cellöden inom HSC-facket, som kallas partiska HSC-kloner. Mekanismerna bakom heterogena eller dåligt reproducerbara resultat är lite förstådda, särskilt när det gäller längden på självförnyelse när renade HSC-fraktioner transplanteras genom konventionell immunfärgning. Att fastställa en reproducerbar isoleringsmetod för långsiktiga HSC (LT-HSC) och kortvariga HSC (ST-HSC), definierad av längden på deras självförnyelse, är därför avgörande för att lösa denna fråga. Med hjälp av opartisk flerstegsscreening identifierade vi en transkriptionsfaktor, Hoxb5, som kan vara en exklusiv markör för LT-HSC i musens hematopoetiska system. Baserat på detta resultat etablerade vi en Hoxb5-rapportmuslinje och isolerade framgångsrikt LT-HSC och ST-HSC. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för isolering av LT-HSC och ST-HSC med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet . Denna isoleringsmetod kommer att hjälpa forskare att bättre förstå mekanismerna för självförnyelse och den biologiska grunden för sådan heterogenitet i HSC-facket.

Introduction

Hematopoetiska stamceller (HSC), som har självförnyelsekapacitet och multipotens, ligger vid toppen av den hematopoetiska hierarkin 1,2. År 1988 visade Weissman och kollegor för första gången att isoleringen av mus HSC kunde uppnås med hjälp av flödescytometri3. Därefter rapporterades en fraktion definierad av en kombination av cellytemarkörer, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 / loFlk2 , innehålla alla HSC i möss 4,5,6,7,8.

Immunofenotypiskt definierade (Lineagec-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2) HSC (nedan kallade pHSC) ansågs tidigare vara funktionellt homogena. Nya encellsanalyser har dock visat att pHSC fortfarande uppvisar heterogenitet med avseende på deras självförnyelsekapacitet 9,10 och multipotens11,12. Specifikt verkar två populationer existera i pHSC-fraktionen med avseende på deras självförnyelsekapacitet: långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC), som har kontinuerlig självförnyelsekapacitet, och kortvariga hematopoetiska stamceller (ST-HSC), som har övergående självförnyelsekapacitet 9,10.

Hittills är de molekylära mekanismerna för självförnyelsekapacitet som skiljer LT-HSC och ST-HSC fortfarande dåligt förstådda. Det är viktigt att isolera båda cellpopulationerna baserat på deras självförnyelsekapacitet och att upptäcka underliggande molekylära mekanismer. Flera rapportsystem har också införts för att rena LT-HSCs13,14,15; LT-HSC-renheten som definieras av varje rapportörsystem är dock variabel, och exklusiv LT-HSC-rening har hittills inte uppnåtts.

Att utveckla ett isoleringssystem för LT-HSC och ST-HSC kommer därför att påskynda forskningen om självförnyelsekapacitet i pHSC-fraktionen. I isoleringen av LT-HSC och ST-HSC identifierade en studie med flerstegs, opartisk screening en enda gen, Hoxb5, som heterogent uttrycks i pHSC-fraktion16. Dessutom avslöjade benmärgsanalys av Hoxb5-reportermössen att cirka 20% -25% av pHSC-fraktionen består av Hoxb5 pos-celler. En kompetitiv transplantationsanalys med Hoxb5 pos pHSC och Hoxb5 neg pHSC avslöjade att endast Hoxb5pos pHSC har långsiktig självförnyelsekapacitet, medan Hoxb5neg pHSC förlorar sin självförnyelsekapacitet inom en kort period, vilket indikerar att Hoxb5 identifierar LT-HSC i pHSC-fraktionen16.

Här demonstrerar vi ett steg-för-steg-protokoll för att isolera LT-HSC och ST-HSC med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet . Dessutom presenterar vi en kompetitiv transplantationsanalys för att bedöma självförnyelsekapaciteten hos Hoxb5pos/neg pHSC (figur 1). Detta Hoxb5-rapportsystem gör det möjligt för oss att prospektivt isolera LT-HSC och ST-HSC och bidrar till förståelsen av LT-HSC-specifika egenskaper.

Protocol

Alla djurförsök som beskrivs godkändes av RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. 1. Förkonditionering av mottagarmössen Förbered möss av typen C57BL / 6 av hankön i åldern 8-10 veckor som mottagarmöss. Antalet mottagarmöss beror på experimentprotokollet. Vi förbereder vanligtvis 10-20 möss för varje tillstånd.Mata mössen med steriliserat vatten kompletterat med enrofloxacin (170 mg/l). Eftersom bestrålade mottagarmöss är mycket mot…

Representative Results

Tidigare har självförnyelsekapaciteten mätts med hjälp av kompetitiva transplantationsanalyser, där donator-HSC tros behålla sin självförnyelsekapacitet endast om flerlinjegivarceller i mottagarens perifera blod observeras17. Dessutom definierar flera rapporter LT-HSC som celler som fortsätter att producera perifera blodkroppar flera månader efter den andra benmärgstransplantationen10,18. För att jämföra deras självförnyels…

Discussion

Traditionellt har cellytemarkördefinierade HSC utarbetats för att studera HSC: s funktioner, såsom självförnyelsekapacitet och multipotens 19,20,21. Den immunofenotypiskt definierade (Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2) HSC-fraktionen innehåller emellertid två diskreta HSC-populationer: LT-HSC och ST-HSCs 9,10<sup class="xref"…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Hiroshi Kiyonari för djurvården och för att ge mottagarmöss på RIKEN BDR, liksom Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka och Masaki Miyahashi för laboratoriehantering vid Kobe University. Författarna uppskattar också det pågående stödet för detta arbete. Masanori Miyanishi stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-bidragsnummer JP17K07407 och JP20H03268, Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, Life Science Foundation of Japan, Takeda Science Foundation, Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders och AMED-PRIME, AMED under bidragsnummer JP18GM6110020. Taro Sakamaki stöds av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 och JP22K16334 och stöddes av JSPS Core-to-Core-programmet och RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi stöddes av JSPS bidragsnummer KAKENHI JP18J13408.

Materials

0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap SSIbio 3230-00
0.5M EDTA pH 8.0 Iinvtrogen AM9260G
100 µm Cell Strainer Falcon 352360
30G insulin syringe BD 326668
40 µm Cell Strainer Falcon 352340
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap FALCON 352235
7-AAD Viability Staining Solution BioLegend 420404
96 well U-Bottom FALCON 351177
Anti-APC-MicroBeads Milteny biotec 130-090-855
Aspirator with trap flask Biosan FTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) BioLegend 103232
B220-Biotin (RA3-6B2) BioLegend 103204
B220-BV786 (RA3-6B2) BD Biosciences 563894
B6.CD45.1 congenic mice  Sankyo Labo Service N/A
Baytril 10% BAYER 341106546
BD FACS Aria II special order system  BD N/A
Brilliant stain buffer BD 566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) BioLegend 101222
CD11b-Biotin (M1/70) BioLegend 101204
CD11b-BUV395 (M1/70) BD Biosciences 563553
CD11b-BV711 (M1/70) BD Biosciences 563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) Invitrogen 56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2) BioLegend 115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) Invitrogen 56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) BD Biosciences 560230
CD34-FITC (RAM34) Invitrogen 11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) BioLegend 100216
CD3ε -Biotin (145-2C11) BioLegend 100304
CD3ε -BV421 (145-2C11) BioLegend 100341
CD45.1/CD45.2 congenic mice N/A N/A Bred in our Laboratory
CD45.1-FITC (A20) BD Biosciences 553775
CD45.2-PE (104) BD Biosciences 560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) BioLegend 100430
CD4-Biotin (GK1.5) BioLegend 100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) BioLegend 100730
CD8a-Biotin (53-6.7) BioLegend 100704
Centrifuge Tube 15ml NICHIRYO 00-ETS-CT-15
Centrifuge Tube 50ml NICHIRYO 00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) Invitrogen 47117182
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid  Nacalai 14249-24
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) eBioscience 46135182
FlowJo version 10 BD Biosciences  https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 Exactor Best theratronics N/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) BioLegend 108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5) BioLegend 108404
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background)  N/A N/A Bred in our Laboratory
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution Sigma-Aldrich I8015-100MG
isoflurane Pfizer 4987-114-13340-3 
Kimwipes S200 NIPPON PAPER CRECIA  6-6689-01
LS Columns Milteny biotec 130-042-401
Lysis buffer  BD 555899
MACS  MultiStand Milteny biotec 130-042-303
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well IWAKI 3810-006
MidiMACS Separator Milteny biotec 130-042-302
Mouse Pie Cages Natsume Seisakusho KN-331
Multipurpose refrigerated Centrifuge TOMY EX-125
NARCOBIT-E (II) Natsume Seisakusho KN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) BioLegend 108728
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution nacalai 26253-84
Porcelain Mortar φ120mm with Pestle Asone 6-549-03
Protein LoBind Tube 1.5 mL  Eppendorf 22431081
Sca-I-BUV395 (D7) BD Biosciences 563990
Stainless steel scalpel blade FastGene FG-B2010
Streptavidin-BUV737 BD Biosciences 612775
SYTOX-red Invitrogen S34859
Tailveiner Restrainer for Mice standard Braintree TV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597) BioLegend 109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) BioLegend 116220
Ter-119-Biotin (TER-119) BioLegend 116204
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe TERUMO SS-05LZ
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 TERUMO NN-2325-R

References

  1. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
  4. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  5. Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
  6. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  7. Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
  8. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  9. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
  10. Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
  11. Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
  12. Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
  13. Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
  14. Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
  15. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  16. Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
  17. Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
  18. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
  19. Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
  20. Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
  21. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  22. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  23. Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
  24. Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
  25. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
  26. Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
  27. Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
check_url/fr/64488?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Nishi, K., Nagasaka, A., Sakamaki, T., Sadaoka, K., Miyanishi, M. Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (195), e64488, doi:10.3791/64488 (2023).

View Video