Vi presenterar ett steg-för-steg-protokoll för isolering av långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC) och kortvariga HSC (ST-HSC) med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet.
Självförnyelsekapacitet och differentieringspotential för flera linjer betraktas allmänt som de definierande egenskaperna hos hematopoetiska stamceller (HSC). Många studier har dock föreslagit att funktionell heterogenitet finns i HSC-facket. Nya encellsanalyser har rapporterat HSC-kloner med olika cellöden inom HSC-facket, som kallas partiska HSC-kloner. Mekanismerna bakom heterogena eller dåligt reproducerbara resultat är lite förstådda, särskilt när det gäller längden på självförnyelse när renade HSC-fraktioner transplanteras genom konventionell immunfärgning. Att fastställa en reproducerbar isoleringsmetod för långsiktiga HSC (LT-HSC) och kortvariga HSC (ST-HSC), definierad av längden på deras självförnyelse, är därför avgörande för att lösa denna fråga. Med hjälp av opartisk flerstegsscreening identifierade vi en transkriptionsfaktor, Hoxb5, som kan vara en exklusiv markör för LT-HSC i musens hematopoetiska system. Baserat på detta resultat etablerade vi en Hoxb5-rapportmuslinje och isolerade framgångsrikt LT-HSC och ST-HSC. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för isolering av LT-HSC och ST-HSC med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet . Denna isoleringsmetod kommer att hjälpa forskare att bättre förstå mekanismerna för självförnyelse och den biologiska grunden för sådan heterogenitet i HSC-facket.
Hematopoetiska stamceller (HSC), som har självförnyelsekapacitet och multipotens, ligger vid toppen av den hematopoetiska hierarkin 1,2. År 1988 visade Weissman och kollegor för första gången att isoleringen av mus HSC kunde uppnås med hjälp av flödescytometri3. Därefter rapporterades en fraktion definierad av en kombination av cellytemarkörer, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 – / loFlk2 −, innehålla alla HSC i möss 4,5,6,7,8.
Immunofenotypiskt definierade (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC (nedan kallade pHSC) ansågs tidigare vara funktionellt homogena. Nya encellsanalyser har dock visat att pHSC fortfarande uppvisar heterogenitet med avseende på deras självförnyelsekapacitet 9,10 och multipotens11,12. Specifikt verkar två populationer existera i pHSC-fraktionen med avseende på deras självförnyelsekapacitet: långsiktiga hematopoetiska stamceller (LT-HSC), som har kontinuerlig självförnyelsekapacitet, och kortvariga hematopoetiska stamceller (ST-HSC), som har övergående självförnyelsekapacitet 9,10.
Hittills är de molekylära mekanismerna för självförnyelsekapacitet som skiljer LT-HSC och ST-HSC fortfarande dåligt förstådda. Det är viktigt att isolera båda cellpopulationerna baserat på deras självförnyelsekapacitet och att upptäcka underliggande molekylära mekanismer. Flera rapportsystem har också införts för att rena LT-HSCs13,14,15; LT-HSC-renheten som definieras av varje rapportörsystem är dock variabel, och exklusiv LT-HSC-rening har hittills inte uppnåtts.
Att utveckla ett isoleringssystem för LT-HSC och ST-HSC kommer därför att påskynda forskningen om självförnyelsekapacitet i pHSC-fraktionen. I isoleringen av LT-HSC och ST-HSC identifierade en studie med flerstegs, opartisk screening en enda gen, Hoxb5, som heterogent uttrycks i pHSC-fraktion16. Dessutom avslöjade benmärgsanalys av Hoxb5-reportermössen att cirka 20% -25% av pHSC-fraktionen består av Hoxb5 pos-celler. En kompetitiv transplantationsanalys med Hoxb5 pos pHSC och Hoxb5 neg pHSC avslöjade att endast Hoxb5pos pHSC har långsiktig självförnyelsekapacitet, medan Hoxb5neg pHSC förlorar sin självförnyelsekapacitet inom en kort period, vilket indikerar att Hoxb5 identifierar LT-HSC i pHSC-fraktionen16.
Här demonstrerar vi ett steg-för-steg-protokoll för att isolera LT-HSC och ST-HSC med hjälp av Hoxb5-rapportsystemet . Dessutom presenterar vi en kompetitiv transplantationsanalys för att bedöma självförnyelsekapaciteten hos Hoxb5pos/neg pHSC (figur 1). Detta Hoxb5-rapportsystem gör det möjligt för oss att prospektivt isolera LT-HSC och ST-HSC och bidrar till förståelsen av LT-HSC-specifika egenskaper.
Traditionellt har cellytemarkördefinierade HSC utarbetats för att studera HSC: s funktioner, såsom självförnyelsekapacitet och multipotens 19,20,21. Den immunofenotypiskt definierade (Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-fraktionen innehåller emellertid två diskreta HSC-populationer: LT-HSC och ST-HSCs 9,10<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Hiroshi Kiyonari för djurvården och för att ge mottagarmöss på RIKEN BDR, liksom Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka och Masaki Miyahashi för laboratoriehantering vid Kobe University. Författarna uppskattar också det pågående stödet för detta arbete. Masanori Miyanishi stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-bidragsnummer JP17K07407 och JP20H03268, Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, Life Science Foundation of Japan, Takeda Science Foundation, Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders och AMED-PRIME, AMED under bidragsnummer JP18GM6110020. Taro Sakamaki stöds av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 och JP22K16334 och stöddes av JSPS Core-to-Core-programmet och RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi stöddes av JSPS bidragsnummer KAKENHI JP18J13408.
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
30G insulin syringe | BD | 326668 | |
40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
Lysis buffer | BD | 555899 | |
MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |