Procédé d’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie

Résumé

Nous décrivons ici l’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées du tissu cancéreux du foie grâce à une méthode d’ultracentrifugation différentielle optimisée.

Résumé

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) dérivées du tissu peuvent refléter l’état fonctionnel des cellules sources et les caractéristiques de l’espace interstitiel du tissu. L’enrichissement efficace de ces sEV est une condition préalable importante à l’étude de leur fonction biologique et une clé pour le développement de techniques de détection clinique et de technologie de support thérapeutique. Il est difficile d’isoler les sEV des tissus, car ils sont généralement fortement contaminés. Cette étude fournit une méthode pour l’enrichissement rapide de sEVs de haute qualité à partir de tissus cancéreux du foie. La méthode implique un processus en quatre étapes: l’incubation des enzymes digestives (collagénase D et DNase Ι) avec les tissus, la filtration à travers une passoire cellulaire de 70 μm, l’ultracentrifugation différentielle et la filtration à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Grâce à l’optimisation de l’étape d’ultracentrifugation différentielle et à l’ajout d’une étape de filtration, la pureté des sEV obtenus par cette méthode est supérieure à celle obtenue par l’ultracentrifugation différentielle classique. Il fournit une méthodologie importante et des données à l’appui pour l’étude des EV dérivés de tissus.

Introduction

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) mesurent environ 30 nm à 150 nm de diamètre et sont sécrétées par diverses cellules¹. Ils peuvent communiquer avec les cellules tissulaires et réguler le microenvironnement local ou distant en transportant des molécules biologiques importantes telles que les lipides, les protéines, l’ADN et l’ARN vers divers organes, tissus, cellules et parties intracellulaires. Ainsi, ils peuvent également modifier le comportement des cellules receveuses ^2,3. L’isolement et la purification de sEVs spécifiques est une condition préalable essentielle à l’étude....

Protocole

Le tissu cancéreux du foie humain a été recueilli chez des patients atteints de malignité hépatique au premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan. Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé et la collecte d’échantillons de tissus humains a été approuvée par le comité d’éthique du premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Préparation

1. Placez l’agitateur décolorant de transfert dans l’incubateur et réglez la te....

Résultats

Les sEV des tissus cancéreux du foie humain ont joué un rôle crucial dans le diagnostic, le traitement et le pronostic des patients atteints d’un cancer du foie. Cette méthode utilisait des instruments de laboratoire courants pour isoler et purifier les sEV dérivés des tissus cancéreux du foie; cela peut fournir un soutien méthodologique pour l’étude des EV. La figure 2 illustre le processus général d’enrichissement des EV à partir des tissus cancéreux du foie. Les sEVs dans les espaces inte.......

Discussion

Ce protocole décrit une méthode reproductible pour extraire les sEV du tissu cancéreux du foie. Les sEVs de haute qualité sont obtenus par isolation nette des tissus, traitement avec des enzymes digestives, ultracentrifugation différentielle et filtration et purification de la membrane filtrante de 0,22 μm. Pour l’analyse en aval, il est extrêmement important de garantir la haute pureté des sEV. Dans le processus de centrifugation différentielle, une couche de substances blanches (composition inconnue) apparaîtra à la su.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 et micro ; m Unité de filtration à membrane	Millex	SLGPR33RB
1 mL Seringue stérile	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2 % Acétate d’uranyle	Microscopie électronique Sciences	22400-2
4,7 mL Tube à centrifuger	Beckman Coulter	361621
6 puits Plaque de cuture cellulaire	LABSELECT	11110
50 mL Bécher	Tianjin Kangyiheng Société de vente d’instruments expérimentaux	CF2100800
70 & micro ; m Passoire cellulaire	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Boîte de culture cellulaire	CELL TER	CS016-0128
600 µ ; L Tube à centrifuger	Axygen	MCT060C
BCA kit de quantification des protéines	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman  ;	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Anticorps	Abcam	ab134045
CD9 Anticorps	Abcam	ab263019
Centrifugeuse 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Solution de nettoyage	NanoFCM	C1801
Collagénase D	Roche	11088866001
Filet de cuivre	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Thermostat sec	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9	Antibody Elabscience E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Anticorps anti-souris secondaire couplé à la peroxydase de raifort de chèvre (HRP)  ;	Proteintech	SA00001-1
Anticorps anti-lapin secondaire couplé à la peroxydase de raifort (HRP)  ;	Proteintech	SA00001-2
Méthanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Cytomètre en flux de nanoparticules	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
inhibiteurs de la phosphatase (PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Servicebio	G4202
Membrane de difluorure de polyvinylidène	Solarbio	ISEQ00010
QC Perles	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 support de base	Biological Industries  ;
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Nanosphères de silice	NanoFCM	S16M-Exo
Transfert Décolorant Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Microscope électronique à transmission	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101	Anticorps Proteintech	28283-1-AP
	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X

C11875500BT Pince à épiler