تصوير الخلايا الحية للكرات الأرضية خارج الجسم الحي السليمة باستخدام حامل مطبوع 3D جديد
Summary
يصف هذا العمل بروتوكولا تجريبيا جديدا يستخدم حاملا مطبوعا ثلاثي الأبعاد لتمكين تصوير الخلايا الحية عالي الدقة للكرات الأرضية المنزوعة. من خلال هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة نشاط إشارات الكالسيوم الخلوية في ظهارة القرنية المصابة من الكرات الأرضية خارج الجسم الحي في الوقت الفعلي.
Abstract
التئام الجروح الظهارية القرنية هو عملية هجرة تبدأ عن طريق تنشيط مستقبلات purinergic المعبر عنها على الخلايا الظهارية. ينتج عن هذا التنشيط أحداث تعبئة الكالسيوم التي تنتشر من خلية إلى أخرى ، وهي ضرورية لبدء الحركة الخلوية في سرير الجرح ، مما يعزز التئام الجروح بكفاءة. طور مختبر Trinkaus-Randall منهجية لتصوير استجابة التئام جروح القرنية في كرات الفئران خارج الجسم الحي في الوقت الفعلي. يتضمن هذا النهج استئصال كرة أرضية سليمة من فأر تم قتله رحيما وفقا للبروتوكولات المعمول بها واحتضان الكرة الأرضية على الفور بصبغة مؤشر الكالسيوم. يمكن تطبيق صبغة مضادة تلطخ الميزات الأخرى للخلية في هذه المرحلة للمساعدة في التصوير وإظهار المعالم الخلوية. عمل البروتوكول بشكل جيد مع العديد من أصباغ الخلايا الحية المختلفة المستخدمة في مكافحة التلطيخ ، بما في ذلك الأكتين SiR لتلطيخ الأكتين وصبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة لتلطيخ غشاء الخلية. لفحص الاستجابة للجرح ، يتم إصابة ظهارة القرنية باستخدام إبرة 25 G ، ويتم وضع الكرات الأرضية في حامل مطبوع 3D. تتم معايرة أبعاد حامل الطباعة 3D لضمان تجميد الكرة الأرضية طوال مدة التجربة ويمكن تعديلها لاستيعاب العيون ذات الأحجام المختلفة. يتم إجراء التصوير بالخلايا الحية لاستجابة الجرح بشكل مستمر على أعماق مختلفة في جميع أنحاء الأنسجة بمرور الوقت باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يسمح لنا هذا البروتوكول بإنشاء صور عالية الدقة وجودة النشر باستخدام هدف هوائي 20x على مجهر متحد البؤر. يمكن أيضا استخدام أهداف أخرى لهذا البروتوكول. وهو يمثل تحسنا كبيرا في جودة تصوير الخلايا الحية في كرات الفئران خارج الجسم الحي ويسمح بتحديد الأعصاب والظهارة.
Introduction
القرنيه
القرنية عبارة عن بنية شفافة غير وعائية تغطي السطح الأمامي للعين والتي تنكسر الضوء لتمكين الرؤية وتحمي الجزء الداخلي من العين من التلف. نظرا لأن القرنية تتعرض للبيئة ، فهي عرضة للتلف من الأسباب الميكانيكية (الخدش) ومن العدوى. عادة ما تلتئم إصابة القرنية في مريض سليم في غضون 1-3 أيام. ومع ذلك ، في المرضى الذين يعانون من حالات كامنة بما في ذلك نقص الخلايا الجذعية الحوفية ومرض السكري من النوع الثاني ، يمكن أن تطول عملية التئام جروح القرنيةبشكل كبير 1. نظرا لأن القرنية معصبة للغاية ، فإن قرح القرنية غير الشافية وتآكل القرنية المتكرر مؤلمة للغاية وتقلل بشكل كبير من نوعية حياة المرضى الذين يعانون منها1.
إشارات الخلية
عندما تصاب قرنية سليمة ، تسبق أحداث إشارات الكالسيوم في الخلايا المجاورة للجرح وتدفع الهجرة الخلوية إلى سرير الجرح ، حيث تغلق الإصابة دون التعرض لخطر التندب 2,3. تم وصف أحداث الإشارات هذه بشكل جيد في نماذج زراعة الخلايا الظهارية للقرنية باستخدام تصوير الخلايا الحية2. تظهر التجارب الأولية إشارات الكالسيوم بشكل ملحوظ بعد الإصابة في الخلايا غير المصابة بالسكري مقارنة بخلايا السكري. ومع ذلك ، فقد ثبت أن توصيف أحداث إشارات الخلية في الكرات الأرضية خارج الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا.
تصوير الخلايا الحية
نجحت الدراسات السابقة في تسجيل أحداث إشارات الكالسيوم من نماذج زراعة الخلايا في المختبر لالتئام جروح القرنية4،5،6. إن تطوير منهجية لإنتاج صور عالية الجودة لأحداث الإشارات هذه في الأنسجة خارج الجسم الحي أمر مهم للغاية لأنه سيسمح بدراسة هذه الأحداث في نظام أكثر تعقيدا وواقعية. تضمنت الأساليب السابقة تشريح القرنية متبوعا بالشلل في جل PEGالناجم عن الأشعة فوق البنفسجية 7،8،9. يعد التثبيت خطوة أساسية ولكنها صعبة عند العمل مع الأنسجة الحية ، حيث يجب أن تظل قابلة للحياة ورطبة طوال فترة التجربة. علاوة على ذلك ، يجب ألا يؤدي الشلل إلى إتلاف الأنسجة. في حين أن حل PEG يجمد الأنسجة ، إلا أن دقة وجودة الصور المنتجة لم تكن متسقة. لذلك ، تم تطوير حوامل مطبوعة 3D لشل حركة الكرات الأرضية السليمة لإنتاج صور عالية الجودة مع مخاطر أقل لتلف الأنسجة.
النهج المتبع
تم تطوير حامل مطبوع 3D فريد من نوعه لشل حركة الكرات الأرضية خارج الجسم الحي لتصوير الخلايا الحية. يمنع هذا الحامل الضرر من مصدرين رئيسيين: فهو يسمح بتصوير الكرة الأرضية المنزوعة النواة دون الحاجة إلى تشريح القرنية ، ويزيل التعرض للأشعة فوق البنفسجية. بدون مصادر الضرر هذه ، مثلت الصور التي تم الحصول عليها بدقة أكبر الاستجابة لإصابات الخدش التي تم إجراؤها تجريبيا. علاوة على ذلك ، تمت معايرة حامل الطباعة 3D إلى الأبعاد الدقيقة لعين الفأر. قدم هذا ملاءمة أفضل بكثير من الشلل في محلول PEG ، مما أدى إلى صورة عالية الجودة في أهداف أقل طاقة بسبب انخفاض حركة الأنسجة. يضمن قضيب الغطاء المتصل بالجزء العلوي من الحامل بقاء الكرة الأرضية غير متحركة طوال مدة التجربة وعدم وجود إزاحة للكرة الأرضية عند تطبيق وسائط النمو للحفاظ على الترطيب والحيوية. تتيح لنا القدرة على طباعة الحامل بأبعاد دقيقة أيضا إنشاء ملاءمة مثالية لعيون الفئران ذات الأحجام المختلفة بسبب العمر أو حالة المرض. يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا على نطاق أوسع لتطوير حوامل لعيون الأنواع المختلفة بناء على أبعادها.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير الخلايا الحية التي تستخدم حامل مطبوع 3D لتثبيت وتثبيت عيون الحيوانات السليمة. إنه مصمم للتحايل على العديد من العيوب المهمة المعترف بها مع بروتوكولات تصوير الخلايا الحية السابقة لأنسجة القرنية خارج الجسم الحي . يوفر هذا البروتوكول العديد من المزايا لتصو…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف بالمعاهد الوطنية للصحة لدعم المنح التالية: RO1EY032079 (VTR) و R21EY029097-01 (VTR) و 1F30EY033647-01 (KS) و 5T32GM008541-24 (KS). نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لصندوق ماساتشوستس ليونز لأبحاث العيون وصندوق نيو إنجلاند لزراعة القرنية.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bio-ingénierie. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
