Imagerie de cellules vivantes de globes ex vivo intacts à l’aide d’un nouveau support imprimé en 3D
Summary
Le présent travail décrit un nouveau protocole expérimental qui utilise un support imprimé en 3D pour permettre l’imagerie de cellules vivantes à haute résolution de globes énucléés. Grâce à ce protocole, l’activité de signalisation cellulaire du calcium dans l’épithélium cornéen blessé des globes ex vivo peut être observée en temps réel.
Abstract
La cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes est un processus migratoire initié par l’activation des récepteurs purinergiques exprimés sur les cellules épithéliales. Cette activation entraîne des événements de mobilisation du calcium qui se propagent de cellule en cellule, ce qui est essentiel pour initier la motilité cellulaire dans le lit de la plaie, favorisant une cicatrisation efficace de la plaie. Le laboratoire Trinkaus-Randall a développé une méthodologie pour imager la réponse de cicatrisation des plaies cornéennes dans des globes murins ex vivo en temps réel. Cette approche consiste à énucléer un globe intact d’une souris qui a été euthanasiée selon les protocoles établis et à incuber immédiatement le globe avec un colorant indicateur de calcium. Une contre-coloration qui colore d’autres caractéristiques de la cellule peut être appliquée à ce stade pour aider à l’imagerie et montrer les points de repère cellulaires. Le protocole a bien fonctionné avec plusieurs colorants de cellules vivantes utilisés pour la contre-coloration, y compris l’actine SiR pour colorer l’actine et la coloration de membrane plasmique rouge foncé pour colorer la membrane cellulaire. Pour examiner la réponse à une plaie, l’épithélium cornéen est blessé à l’aide d’une aiguille de 25 G et les globes sont placés dans un support imprimé en 3D. Les dimensions du support imprimé en 3D sont calibrées pour assurer l’immobilisation du globe pendant toute la durée de l’expérience et peuvent être modifiées pour accueillir des yeux de différentes tailles. L’imagerie cellulaire vivante de la réponse de la plaie est réalisée en continu à différentes profondeurs dans tout le tissu au fil du temps à l’aide de la microscopie confocale. Ce protocole nous permet de générer des images haute résolution et de qualité publication à l’aide d’un objectif d’air 20x sur un microscope confocal. D’autres objectifs peuvent également être utilisés pour ce protocole. Il représente une amélioration significative de la qualité de l’imagerie des cellules vivantes dans les globes murins ex vivo et permet l’identification des nerfs et de l’épithélium.
Introduction
Cornée
La cornée est une structure avasculaire claire recouvrant la surface antérieure de l’œil qui réfracte la lumière pour permettre la vision et protéger l’intérieur de l’œil contre les dommages. Comme la cornée est exposée à l’environnement, elle est sensible aux dommages causés à la fois par des causes mécaniques (rayures) et par une infection. Une lésion cornéenne chez un patient par ailleurs en bonne santé guérit généralement en 1 à 3 jours. Cependant, chez les patients atteints de maladies sous-jacentes, notamment un déficit en cellules souches limbiques et un diabète de type II, le processus de cicatrisation des plaies cornéennes peut être considérablement prolongé1. La cornée étant fortement innervée, ces ulcères cornéens non cicatrisants et ces érosions cornéennes récurrentes sont très douloureux et diminuent grandement la qualité de vie des patients qui en souffrent1.
Signalisation cellulaire
Lorsqu’une cornée par ailleurs saine est blessée, les événements de signalisation calcique dans les cellules adjacentes à la plaie précèdent et provoquent la migration cellulaire dans le lit de la plaie, où ils ferment la blessure sans risque de cicatrisation 2,3. Ces événements de signalisation ont été bien caractérisés dans des modèles de culture de cellules épithéliales cornéennes utilisant l’imagerie de cellules vivantes2. Des expériences préliminaires démontrent significativement plus de signalisation calcique après une lésion dans les cellules non diabétiques par rapport aux cellules diabétiques. Cependant, la caractérisation des événements de signalisation cellulaire dans les globes ex vivo s’est avérée être un défi technique.
Imagerie de cellules vivantes
Des études antérieures ont enregistré avec succès des événements de signalisation du calcium à partir de modèles de culture cellulaire in vitro de cicatrisation des plaies cornéennes 4,5,6. Le développement d’une méthodologie pour produire des images de haute qualité de ces événements de signalisation dans des tissus ex vivo est d’un grand intérêt car cela permettrait l’étude de ces événements dans un système plus complexe et réaliste. Les approches précédentes ont impliqué la dissection de la cornée suivie d’une immobilisation dans un gel PEG induit par UV 7,8,9. L’immobilisation est une étape essentielle mais difficile lorsque l’on travaille avec des tissus vivants, car ils doivent rester viables et hydratés tout au long de l’expérience. De plus, l’immobilisation ne doit pas endommager le tissu. Bien que la solution de PEG ait immobilisé le tissu, la résolution et la qualité des images produites n’étaient pas cohérentes. Par conséquent, les supports imprimés en 3D ont été développés pour immobiliser les globes intacts afin de produire des images de meilleure qualité avec moins de risque de lésions tissulaires.
L’approche
Un support unique imprimé en 3D a été développé pour immobiliser des globes ex vivo intacts pour l’imagerie de cellules vivantes. Ce support prévient les dommages provenant de deux sources principales: il permet l’imagerie d’un globe énucléé sans avoir besoin de disséquer la cornée, et il élimine l’exposition à la lumière UV. Sans ces sources de dommages, les images obtenues représentaient plus précisément la réponse aux blessures par égratignures faites expérimentalement. De plus, le support imprimé en 3D a été calibré aux dimensions précises de l’œil murin. Cela a fourni un bien meilleur ajustement que l’immobilisation dans la solution PEG, conduisant à une image de meilleure qualité à des objectifs de puissance inférieure en raison de la diminution du mouvement des tissus. Une barre de couverture fixée au sommet du support garantit que le globe reste immobile pendant toute la durée de l’expérience et qu’il n’y a pas de déplacement du globe lorsque le milieu de croissance est appliqué pour maintenir l’hydratation et la viabilité. La possibilité d’imprimer le support à des dimensions précises nous permet également de générer un ajustement optimal pour les yeux murins de différentes tailles en raison de l’âge ou de l’état de la maladie. Cette technologie peut être appliquée plus largement pour développer des supports pour les yeux de différentes espèces en fonction de leurs dimensions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une technique d’imagerie de cellules vivantes qui utilise un support imprimé en 3D pour stabiliser et immobiliser les yeux intacts des animaux. Il est conçu pour contourner plusieurs inconvénients importants reconnus avec les protocoles précédents d’imagerie de cellules vivantes du tissu cornéen ex vivo . Ce protocole offre de nombreux avantages pour l’imagerie de cellules vivantes de globes intacts. Il réduit considérablement les dommages tissulaires inutiles qui pourraient in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les NIH pour le soutien de subvention suivant: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) et 5T32GM008541-24 (KS). Nous tenons également à remercier le Massachusetts Lions Eye Research Fund et le New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
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