新しい3Dプリントホルダーを使用した無傷の ex vivo グローブの生細胞イメージング
Summary
本研究では、3Dプリントホルダーを利用して、除核球体の高解像度ライブセルイメージングを可能にする新しい実験プロトコルについて説明します。このプロトコルを通じて、 ex vivo グローブからの創傷角膜上皮における細胞カルシウムシグナル伝達活性をリアルタイムで観察することができる。
Abstract
角膜上皮創傷治癒は、上皮細胞上に発現するプリン作動性受容体の活性化によって開始される遊走過程である。この活性化は、細胞から細胞へと伝播するカルシウム動員イベントをもたらし、これは創傷床への細胞運動を開始するために不可欠であり、効率的な創傷治癒を促進する。Trinkaus-Randall研究室は、 ex vivo マウスグローブの角膜創傷治癒反応をリアルタイムでイメージングするための方法論を開発しました。このアプローチでは、確立されたプロトコルに従って安楽死させたマウスから無傷のグローブを取り出し、カルシウム指示色素でグローブを直ちにインキュベートします。細胞の他の特徴を染色する対比染色をこの段階で適用して、イメージングを支援し、細胞のランドマークを示すことができます。このプロトコルは、アクチンを染色するSiRアクチンや細胞膜を染色するための深赤色原形質膜染色など、対比染色に使用されるいくつかの異なる生細胞色素でうまく機能しました。創傷への反応を調べるために、25Gの針を使用して角膜上皮を損傷し、グローブを3Dプリントされたホルダーに入れます。3Dプリントされたホルダーの寸法は、実験期間中の地球儀の固定化を確実にするために調整され、さまざまなサイズの目に対応するように変更できます。創傷応答のライブセルイメージングは、共焦点顕微鏡を用いて経時的に組織全体の様々な深さで連続的に行われる。このプロトコルにより、共焦点顕微鏡で20倍の空気対物レンズを使用して、高解像度の出版品質の画像を生成できます。このプロトコルには、他の目的も使用できます。これは、 ex vivo マウスグローブでの生細胞イメージングの品質の大幅な改善を表し、神経と上皮の識別を可能にします。
Introduction
角膜
角膜は、目の前面を覆う透明な無血管構造であり、光を屈折させて視力を可能にし、目の内部を損傷から保護します。角膜は環境にさらされているため、機械的原因(引っかき傷)と感染の両方による損傷を受けやすくなります。他の点では健康な患者の角膜損傷は、通常1〜3日以内に治癒します。しかし、辺縁系幹細胞欠損症やII型糖尿病などの基礎疾患のある患者では、角膜創傷治癒プロセスを大幅に延長することができます1。角膜は高度に神経支配されているため、これらの非治癒性の角膜潰瘍と再発性角膜びらんは非常に痛みを伴い、それらを経験している患者の生活の質を大幅に低下させます1。
細胞シグナル伝達
他の点では健康な角膜が損傷すると、創傷に隣接する細胞内のカルシウムシグナル伝達イベントが先行し、創傷床への細胞移動を促し、そこで瘢痕化のリスクなしに損傷を閉じます2,3。これらのシグナル伝達イベントは、ライブセルイメージングを用いた角膜上皮細胞培養モデルで十分に特徴付けられています2。予備実験は、糖尿病細胞と比較して、非糖尿病細胞における傷害後の有意に多くのカルシウムシグナル伝達を実証する。しかしながら、ex vivoグローブにおける細胞シグナル伝達事象の特性評価は、技術的な課題であることが証明されている。
ライブセルイメージング
以前の研究では、角膜創傷治癒のin vitro細胞培養モデルからのカルシウムシグナル伝達イベントを記録することに成功しています4、5、6。ex vivo組織におけるこれらのシグナル伝達事象の高品質の画像を生成する方法論を開発することは、より複雑で現実的なシステムでこれらの事象の研究を可能にするため、非常に興味深いものである。以前のアプローチは、角膜の解剖とそれに続くUV誘発PEGゲルへの固定化を含んでいた7、8、9。固定化は、実験の過程を通して生存可能で水和されたままでなければならないため、生きた組織を扱う際に不可欠でありながら困難なステップです。さらに、固定化は組織を傷つけてはならない。PEG溶液は組織を固定化しましたが、生成された画像の解像度と品質は一貫していませんでした。そのため、3Dプリントホルダーは、無傷の地球儀を固定して、組織の損傷のリスクが少なく高品質の画像を生成するために開発されました。
アプローチ
生細胞イメージングのために無傷の ex vivo グローブを固定化するために、独自の3Dプリントホルダーが開発されました。このホルダーは、角膜を解剖することなく除核球体のイメージングを可能にし、紫外線への曝露を排除するという2つの主要な光源からの損傷を防ぎます。これらの損傷源がなければ、得られた画像は、実験的に行われた引っかき傷に対する反応をより正確に表した。さらに、3Dプリントされたホルダーは、マウスアイの正確な寸法に合わせてキャリブレーションされました。これにより、PEG溶液での固定よりもはるかに優れたフィット感が得られ、組織の動きが減少するため、低出力の対物レンズでより高品質の画像が得られます。ホルダーの上部に取り付けられたカバーバーは、実験期間中、グローブが動かないままであり、水分補給と生存能力を維持するために成長培地が適用されたときにグローブが変位しないようにします。ホルダーを正確な寸法に印刷する機能により、年齢や病気の状態に応じてさまざまなサイズのマウスの目に最適なフィット感を生成することもできます。この技術は、寸法に基づいて異なる種の目のホルダーを開発するために、より広く適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、3Dプリントされたホルダーを使用して無傷の動物の目を安定させ、固定化する生細胞イメージング技術について説明しています。これは、 ex vivo 角膜組織の以前の生細胞イメージングプロトコルで認識されたいくつかの重大な欠点を回避するように設計されています。このプロトコルは、インタクトグローブのライブセルイメージングに多くの利点を提供します。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RO1EY032079 (VTR)、R21EY029097-01 (VTR)、1F30EY033647-01 (KS)、および 5T32GM008541-24 (KS) の無償資金協力に感謝いたします。また、マサチューセッツ・ライオンズ眼科研究基金とニューイングランド角膜移植基金にも感謝します。
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
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