새로운 3D 프린팅 홀더를 사용한 온전한 생체 외 구체의 라이브 셀 이미징
Summary
본 연구는 핵이 있는 구체의 고해상도 라이브 셀 이미징을 가능하게 하기 위해 3D 프린팅 홀더를 활용하는 새로운 실험 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 생체 외 글로브 에서 상처 입은 각막 상피의 세포 칼슘 신호 전달 활성을 실시간으로 관찰 할 수 있습니다.
Abstract
각막 상피 상처 치유는 상피 세포에서 발현되는 퓨린 성 수용체의 활성화에 의해 시작되는 이동 과정입니다. 이 활성화는 세포에서 세포로 전파되는 칼슘 동원 이벤트를 초래하며, 이는 상처 침대로의 세포 운동성을 시작하여 효율적인 상처 치유를 촉진하는 데 필수적입니다. 트링카우스-랜달 연구실은 생체 외 쥐 구체에서 각막 상처 치유 반응을 실시간으로 이미징하는 방법론을 개발했습니다. 이 접근법은 확립 된 프로토콜에 따라 안락사 된 마우스에서 손상되지 않은 지구를 핵 제거하고 칼슘 지시제 염료로 지구를 즉시 배양하는 것을 포함합니다. 이 단계에서 세포의 다른 특징을 염색하는 카운터 염색을 적용하여 이미징을 돕고 세포 랜드 마크를 보여줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 액틴을 염색하는 SiR 액틴과 세포막을 염색하는 진한 적색 원형질막 염색을 포함하여 카운터 염색에 사용되는 여러 가지 살아있는 세포 염료와 잘 작동했습니다. 상처에 대한 반응을 검사하기 위해 25G 바늘을 사용하여 각막 상피를 손상시키고 지구본을 3D 인쇄 홀더에 넣습니다. 3D 프린팅 홀더의 치수는 실험 기간 동안 지구본의 고정을 보장하도록 보정되며 다양한 크기의 눈을 수용하도록 수정할 수 있습니다. 상처 반응의 라이브 셀 이미징은 컨포칼 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 조직 전체에 걸쳐 다양한 깊이에서 연속적으로 수행됩니다. 이 프로토콜을 사용하면 컨포칼 현미경에서 20x 공기 대물렌즈를 사용하여 고해상도 출판 품질의 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 다른 목표도 사용할 수 있습니다. 이는 생체 외 뮤린 글로브에서 생세포 영상의 품질을 크게 개선했으며 신경과 상피의 식별을 허용합니다.
Introduction
각막
각막은 눈의 앞쪽 표면을 덮고 있는 투명한 무혈관 구조로, 빛을 굴절시켜 시력을 가능하게 하고 눈 내부를 손상으로부터 보호합니다. 각막은 환경에 노출되기 때문에 기계적 원인(긁힘)과 감염으로 인한 손상을 받기 쉽습니다. 건강한 환자의 각막 손상은 일반적으로 1-3 일 이내에 치유됩니다. 그러나 윤부 줄기 세포 결핍 및 제 2 형 당뇨병을 포함한 기저 질환이있는 환자의 경우 각막 상처 치유 과정이 크게 연장 될 수 있습니다1. 각막이 고도로 신경이 분포되어 있기 때문에 이러한 치유되지 않는 각막 궤양과 재발성 각막 침식은 매우 고통스럽고 이를 경험하는 환자의 삶의 질을 크게 저하시킵니다1.
세포 신호 전달
건강한 각막이 손상되면 상처에 인접한 세포에서 칼슘 신호 이벤트가 선행되어 상처 침대로 세포 이동을 촉진하여 흉터 2,3의 위험없이 손상을 닫습니다. 이러한 신호전달 이벤트는 라이브세포 이미징을 사용하는 각막 상피 세포 배양 모델에서 잘 특성화되었습니다2. 예비 실험은 당뇨병 세포에 비해 비 당뇨병 세포에서 손상 후 훨씬 더 많은 칼슘 신호 전달을 보여줍니다. 그러나 생체 외 글로브에서 세포 신호 전달 이벤트의 특성 분석은 기술적 과제임이 입증되었습니다.
라이브 셀 이미징
이전 연구에서는 각막 상처 치유의 시험관 내 세포 배양 모델에서 칼슘 신호 전달 이벤트를 성공적으로 기록했습니다 4,5,6. 생체 외 조직에서 이러한 신호 이벤트의 고품질 이미지를 생성하는 방법론을 개발하는 것은 보다 복잡하고 실제와 같은 시스템에서 이러한 이벤트를 연구할 수 있기 때문에 큰 관심을 끌고 있습니다. 이전의 접근법은 각막의 해부에 이어 UV 유도 PEG 겔 7,8,9에서의 고정화를 포함하였다. 고정화는 살아있는 조직으로 작업할 때 필수적이지만 어려운 단계로, 실험 과정 내내 실행 가능하고 수분을 유지해야 합니다. 또한, 고정은 조직을 손상시키지 않아야합니다. PEG 용액이 조직을 고정화하는 동안, 생성된 이미지의 해상도와 품질은 일관되지 않았다. 따라서 3D 프린팅 홀더는 손상되지 않은 지구본을 고정하여 조직 손상 위험이 적은 고품질 이미지를 생성하기 위해 개발되었습니다.
접근 방식
고유한 3D 프린팅 홀더는 라이브 셀 이미징을 위해 손상되지 않은 생체 외 글로브를 고정하기 위해 개발되었습니다. 이 홀더는 두 가지 주요 원인으로 인한 손상을 방지합니다: 각막을 해부할 필요 없이 핵이 있는 지구를 이미징할 수 있고 자외선에 대한 노출을 제거합니다. 이러한 손상 원이 없으면 얻은 이미지는 실험적으로 만들어진 스크래치 부상에 대한 반응을보다 정확하게 나타냅니다. 또한 3D 인쇄 홀더는 쥐 눈의 정확한 치수로 보정되었습니다. 이는 PEG 용액에 고정화하는 것보다 훨씬 더 잘 맞았으며, 조직 움직임 감소로 인해 저전력 대물렌즈에서 더 높은 품질의 이미지를 얻을 수 있었습니다. 홀더 상단에 부착된 커버 바는 실험 기간 동안 지구가 움직이지 않고 수화와 생존력을 유지하기 위해 성장 배지를 적용할 때 지구본이 변위되지 않도록 합니다. 홀더를 정확한 치수로 인쇄 할 수있는 기능을 통해 연령이나 질병 상태로 인해 다양한 크기의 쥐 눈에 최적의 맞춤을 생성 할 수 있습니다. 이 기술은 크기에 따라 다른 종의 눈을 위한 홀더를 개발하는 데 보다 광범위하게 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 3D 프린팅 홀더를 사용하여 손상되지 않은 동물의 눈을 안정화하고 고정시키는 라이브 셀 이미징 기술을 설명합니다. 이는 생체 외 각막 조직의 이전 라이브 셀 이미징 프로토콜에서 인식된 몇 가지 중요한 단점을 우회하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 온전한 구체의 라이브 셀 이미징에 많은 이점을 제공합니다. 실험적으로 유도 된 스크래치 상처에 대한 상처 치유 반?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) 및 5T32GM008541-24 (KS)의 보조금 지원에 대해 NIH에 감사드립니다. 또한 매사추세츠 라이온스 안구 연구 기금과 뉴잉글랜드 각막 이식 기금에 감사드립니다.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bio-ingénierie. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
