Live-Cell Imaging av intakt Ex Vivo Globes Bruke en roman 3D-trykt holder
Summary
Det nåværende arbeidet beskriver en ny eksperimentell protokoll som bruker en 3D-trykt holder for å muliggjøre høyoppløselig levende celleavbildning av enukleerte glober. Gjennom denne protokollen kan den cellulære kalsiumsignalaktiviteten i såret hornhinneepitel fra ex vivo-globuser observeres i sanntid.
Abstract
Kornealepitelial sårheling er en migrerende prosess initiert ved aktivering av purinerge reseptorer uttrykt på epitelceller. Denne aktiveringen resulterer i kalsiummobiliseringshendelser som forplanter seg fra celle til celle, som er avgjørende for å initiere cellulær motilitet i sårsengen, og fremmer effektiv sårheling. Trinkaus-Randall-laboratoriet har utviklet en metodikk for å avbilde hornhinnens sårhelingsrespons i ex vivo murine globuser i sanntid. Denne tilnærmingen innebærer å enukleere en intakt klode fra en mus som har blitt avlivet i henhold til etablerte protokoller og umiddelbart inkubere kloden med et kalsiumindikatorfargestoff. En motbeis som flekker andre funksjoner i cellen, kan brukes på dette stadiet for å hjelpe til med avbildning og vise cellulære landemerker. Protokollen fungerte bra med flere forskjellige levende cellefarger som ble brukt til motfarging, inkludert SiR-aktin for å farge aktin og dyprød plasmamembranflekk for å farge cellemembranen. For å undersøke responsen på et sår, er hornhinneepitelet skadet ved hjelp av en 25 G nål, og globusene er plassert i en 3D-trykt holder. Dimensjonene til den 3D-printede holderen er kalibrert for å sikre immobilisering av kloden gjennom hele eksperimentets varighet og kan endres for å imøtekomme øyne av forskjellige størrelser. Levende celleavbildning av sårresponsen utføres kontinuerlig på ulike dybder i vevet over tid ved hjelp av konfokalmikroskopi. Denne protokollen lar oss generere bilder med høy oppløsning i publikasjonskvalitet ved hjelp av et 20x luftmål på et konfokalmikroskop. Andre mål kan også brukes til denne protokollen. Det representerer en betydelig forbedring i kvaliteten på levende cellebilder i ex vivo murine globuser og tillater identifisering av nerver og epitel.
Introduction
Hornhinne
Hornhinnen er en klar, avaskulær struktur som dekker øyets fremre overflate som bryter lys for å muliggjøre syn og beskytter øyets indre mot skade. Siden hornhinnen er utsatt for miljøet, er den utsatt for skade fra både mekaniske årsaker (riper) og fra infeksjon. En hornhinneskade hos en ellers sunn pasient helbreder vanligvis innen 1-3 dager. Hos pasienter med underliggende tilstander, inkludert limbal stamcellemangel og type II diabetes, kan imidlertid hornhinnens sårheling forlenges kraftig1. Siden hornhinnen er svært innervert, er disse ikke-helbredende hornhinnenesårene og tilbakevendende hornhinde erosjoner svært smertefulle og reduserer livskvaliteten til pasienter som opplever dem1.
Cell signalering
Når en ellers sunn hornhinne er skadet, går kalsiumsignalhendelser i cellene ved siden av såret foran og ber om cellulær migrasjon i sårsengen, hvor de lukker skaden uten risiko for arrdannelse 2,3. Disse signalhendelsene har blitt godt karakterisert i hornhinneepitelcellekulturmodeller ved bruk av levende celleavbildning2. Foreløpige eksperimenter viser betydelig mer kalsiumsignalering etter skade i ikke-diabetiske celler sammenlignet med diabetiske celler. Karakterisering av cellesignaleringshendelsene i ex vivo-globuser har imidlertid vist seg å være en teknisk utfordring.
Bildebehandling av levende celler
Tidligere studier har vellykket registrert kalsiumsignaleringshendelser fra in vitro cellekulturmodeller av hornhinnens sårheling 4,5,6. Å utvikle en metodikk for å produsere bilder av høy kvalitet av disse signalhendelsene i ex vivo-vev er av stor interesse fordi det ville tillate studiet av disse hendelsene i et mer komplekst og naturtro system. Tidligere tilnærminger har involvert disseksjon av hornhinnen etterfulgt av immobilisering i en UV-indusert PEG-gel 7,8,9. Immobilisering er et viktig, men utfordrende skritt når du arbeider med levende vev, da det må forbli levedyktig og hydrert i løpet av forsøket. Videre må immobilisering ikke skade vevet. Mens PEG-løsningen immobiliserte vevet, var oppløsningen og kvaliteten på de produserte bildene ikke konsistente. Derfor ble 3D-printede holdere utviklet for å immobilisere intakte globuser for å produsere bilder av høyere kvalitet med mindre risiko for vevskader.
Tilnærmingen
En unik 3D-printet holder ble utviklet for å immobilisere intakte ex vivo globuser for levende cellebilder. Denne holderen forhindrer skade fra to hovedkilder: det tillater avbildning av en enukleert klode uten behov for å dissekere hornhinnen, og det eliminerer eksponering for UV-lys. Uten disse kildene til skade representerte bildene som ble oppnådd mer nøyaktig responsen på ripeskadene som ble gjort eksperimentelt. Videre ble den 3D-printede holderen kalibrert til de nøyaktige dimensjonene til murine eye. Dette ga en mye bedre passform enn immobilisering i PEG-løsning, noe som førte til et bilde av høyere kvalitet ved lavere drevne mål på grunn av redusert vevsbevegelse. En dekselstang festet til toppen av holderen sikrer at kloden forblir immobil gjennom hele eksperimentets varighet, og at det ikke er noen forskyvning av kloden når vekstmedier påføres for å opprettholde hydrering og levedyktighet. Muligheten til å skrive ut holderen til presise dimensjoner gjør det også mulig for oss å generere en optimal passform for murine øyne i forskjellige størrelser på grunn av alder eller sykdomsstatus. Denne teknologien kan brukes bredere for å utvikle holdere for øynene til forskjellige arter basert på deres dimensjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en levende celleavbildningsteknikk som bruker en 3D-trykt holder for å stabilisere og immobilisere intakte dyreøyne. Den er designet for å omgå flere betydelige ulemper anerkjent med tidligere levende celleavbildningsprotokoller av ex vivo hornhinnevev. Denne protokollen gir mange fordeler for levende celleavbildning av intakte globuser. Det reduserer unødvendig vevskader betydelig som kan forstyrre sårhelingsresponsen på eksperimentelt induserte ripesår. Dette inkluderer skad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne anerkjenne NIH for følgende tilskuddsstøtte: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) og 5T32GM008541-24 (KS). Vi vil også anerkjenne Massachusetts Lions Eye Research Fund og New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bio-ingénierie. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
