Imágenes de células vivas de globos intactos ex vivo utilizando un novedoso soporte impreso en 3D
Summary
El presente trabajo describe un novedoso protocolo experimental que utiliza un soporte impreso en 3D para permitir imágenes de células vivas de alta resolución de globos enucleados. A través de este protocolo, la actividad de señalización de calcio celular en el epitelio corneal herido de globos ex vivo se puede observar en tiempo real.
Abstract
La cicatrización de heridas epiteliales corneales es un proceso migratorio iniciado por la activación de receptores purinérgicos expresados en las células epiteliales. Esta activación da como resultado eventos de movilización de calcio que se propagan de célula a célula, que son esenciales para iniciar la motilidad celular en el lecho de la herida, promoviendo la cicatrización eficiente de la herida. El laboratorio de Trinkaus-Randall ha desarrollado una metodología para obtener imágenes de la respuesta de cicatrización de heridas corneales en globos murinos ex vivo en tiempo real. Este enfoque implica la enucleación de un globo intacto de un ratón que ha sido sacrificado según los protocolos establecidos e inmediatamente la incubación del globo con un tinte indicador de calcio. Una contratinción que tiñe otras características de la célula se puede aplicar en esta etapa para ayudar con las imágenes y mostrar puntos de referencia celulares. El protocolo funcionó bien con varios colorantes de células vivas diferentes utilizados para la contratinción, incluida la actina SiR para teñir la actina y la tinción de la membrana plasmática de color rojo intenso para teñir la membrana celular. Para examinar la respuesta a una herida, el epitelio corneal se lesiona con una aguja de 25 G, y los globos se colocan en un soporte impreso en 3D. Las dimensiones del soporte impreso en 3D están calibradas para garantizar la inmovilización del globo durante toda la duración del experimento y se pueden modificar para adaptarse a ojos de diferentes tamaños. Las imágenes de células vivas de la respuesta de la herida se realizan continuamente a varias profundidades en todo el tejido a lo largo del tiempo utilizando microscopía confocal. Este protocolo nos permite generar imágenes de alta resolución y calidad de publicación utilizando un objetivo de aire 20x en un microscopio confocal. Otros objetivos también se pueden utilizar para este protocolo. Representa una mejora significativa en la calidad de las imágenes de células vivas en globos murinos ex vivo y permite la identificación de nervios y epitelio.
Introduction
Córnea
La córnea es una estructura transparente y avascular que cubre la superficie anterior del ojo que refracta la luz para permitir la visión y protege el interior del ojo del daño. Como la córnea está expuesta al medio ambiente, es susceptible al daño tanto por causas mecánicas (rascado) como por infección. Una lesión corneal en un paciente sano generalmente se cura dentro de 1-3 días. Sin embargo, en pacientes con afecciones subyacentes, incluida la deficiencia de células madre limbares y la diabetes tipo II, el proceso de cicatrización de la herida corneal puede prolongarse en gran medida1. Como la córnea está altamente inervada, estas úlceras corneales que no cicatrizan y las erosiones corneales recurrentes son muy dolorosas y disminuyen en gran medida la calidad de vida de los pacientes que las experimentan1.
Señalización celular
Cuando una córnea sana se lesiona, los eventos de señalización de calcio en las células adyacentes a la herida preceden y provocan la migración celular al lecho de la herida, donde cierran la lesión sin riesgo de cicatrización 2,3. Estos eventos de señalización han sido bien caracterizados en modelos de cultivo de células epiteliales corneales utilizando imágenes de células vivas2. Los experimentos preliminares demuestran significativamente más señalización de calcio después de una lesión en células no diabéticas en comparación con las células diabéticas. Sin embargo, la caracterización de los eventos de señalización celular en globos ex vivo ha demostrado ser un desafío técnico.
Imágenes de células vivas
Estudios previos han registrado con éxito eventos de señalización de calcio a partir de modelos de cultivo celular in vitro de cicatrización de heridas corneales 4,5,6. El desarrollo de una metodología para producir imágenes de alta calidad de estos eventos de señalización en tejido ex vivo es de gran interés porque permitiría el estudio de estos eventos en un sistema más complejo y real. Los enfoques anteriores han implicado la disección de la córnea seguida de la inmovilización en un gel PEG inducido por UV 7,8,9. La inmovilización es un paso esencial pero desafiante cuando se trabaja con tejido vivo, ya que debe permanecer viable e hidratado durante todo el transcurso del experimento. Además, la inmovilización no debe dañar el tejido. Mientras que la solución de PEG inmovilizó el tejido, la resolución y la calidad de las imágenes producidas no fueron consistentes. Por lo tanto, los soportes impresos en 3D se desarrollaron para inmovilizar globos intactos para producir imágenes de mayor calidad con menos riesgo de daño tisular.
El enfoque
Se desarrolló un soporte impreso en 3D único para inmovilizar globos intactos ex vivo para obtener imágenes de células vivas. Este soporte evita el daño de dos fuentes principales: permite obtener imágenes de un globo enucleado sin la necesidad de diseccionar la córnea y elimina la exposición a la luz UV. Sin estas fuentes de daño, las imágenes obtenidas representaron con mayor precisión la respuesta a las lesiones por rasguños realizadas experimentalmente. Además, el soporte impreso en 3D se calibró con las dimensiones precisas del ojo murino. Esto proporcionó un ajuste mucho mejor que la inmovilización en la solución PEG, lo que llevó a una imagen de mayor calidad en objetivos de menor potencia debido a la disminución del movimiento del tejido. Una barra de cubierta unida a la parte superior del soporte asegura que el globo permanezca inmóvil durante toda la duración del experimento y que no haya desplazamiento del globo cuando se aplica un medio de crecimiento para mantener la hidratación y la viabilidad. La capacidad de imprimir el soporte a dimensiones precisas también nos permite generar un ajuste óptimo para ojos murinos de diferentes tamaños debido a la edad o estado de la enfermedad. Esta tecnología se puede aplicar más ampliamente para desarrollar soportes para los ojos de diferentes especies en función de sus dimensiones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe una técnica de imagen de células vivas que utiliza un soporte impreso en 3D para estabilizar e inmovilizar los ojos intactos de los animales. Está diseñado para eludir varias desventajas significativas reconocidas con protocolos previos de imágenes de células vivas de tejido corneal ex vivo . Este protocolo ofrece muchas ventajas para la obtención de imágenes de células vivas de globos intactos. Reduce significativamente el daño tisular innecesario que podría interferir con la …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a los NIH por el siguiente apoyo de subvención: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) y 5T32GM008541-24 (KS). También nos gustaría reconocer al Fondo de Investigación del Ojo de los Leones de Massachusetts y al Fondo de Trasplante de Córnea de Nueva Inglaterra.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bio-ingénierie. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
