Plastoglobule lipiddråbeisolering fra plantebladvæv og cyanobakterier
Summary
En hurtig og effektiv protokol præsenteres til isolering af plastoglobulelipiddråber forbundet med forskellige fotosyntetiske organismer. Den vellykkede forberedelse af isolerede plastoglobuler er et afgørende første skridt, der går forud for detaljerede molekylære undersøgelser såsom proteomiske og lipidomiske analyser.
Abstract
Plastoglobulelipiddråber er et dynamisk underrum af plantekloroplaster og cyanobakterier. Fundet allestedsnærværende blandt fotosyntetiske arter, menes de at tjene en central rolle i tilpasningen og ombygningen af thylakoidmembranen under hurtigt skiftende miljøforhold. Kapaciteten til at isolere plastoglobuler af høj renhed har i høj grad lettet deres undersøgelse gennem proteomiske, lipidomiske og andre metoder. Med plastoglobuler med høj renhed og udbytte er det muligt at undersøge deres lipid- og proteinsammensætning, enzymatisk aktivitet og proteintopologi, blandt andre mulige molekylære egenskaber. Denne artikel præsenterer en hurtig og effektiv protokol til isolering af plastoglobuler fra kloroplaster af plantebladvæv og præsenterer metodologiske variationer til isolering af plastoglobuler og beslægtede lipiddråbestrukturer fra majsblade, det udtørrede bladvæv fra opstandelsesplanten, Eragrostis nindensis, og cyanobakterien, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolering er afhængig af den lave densitet af disse lipidrige partikler, hvilket letter deres oprensning ved flotation af saccharosedensitet. Denne metode vil vise sig værdifuld i undersøgelsen af plastoglobuler fra forskellige arter.
Introduction
Den nuværende forståelse af plastoglobulesammensætning og funktion er fremkommet gennem detaljerede proteomiske og lipidomiske undersøgelser 1,2,3,4,5. Sådanne undersøgelser er i høj grad blevet hjulpet af en hurtig og effektiv isolationsmetode, der er afhængig af deres meget lave densitet for effektiv adskillelse ved hjælp af saccharosegradienter. Indledende metoder til plastoglobuleisolering blev opnået fra arter som bøgetræet (Fagus sylvatica), skotsk kost (Sarothamnus scoparius), løg (Allium cepa), spinat (Spinacia oleracea), stedmoderblomst (Viola tricolor), peber (Capsicum annuum) og ærter (Pisum sativum) 6,7,8,9,10,11 ,12,13. En opdateret metode til at isolere kloroplastplastplastlobuler på en mere effektiv og bedre eftergivende måde blev senere præsenteret af Ytterberg et al.3,14. Mens vi oprindeligt blev anvendt til undersøgelse af plastoglobuler af Arabidopsis thaliana bladkloroplaster, har vi med succes anvendt denne opdaterede metode til det sunde bladvæv fra andre plantearter, både monocot og dicot, herunder majs (Zea mays), tomat (Solanum lycopersicum), kærlighedsgræs (Eragrostis nindensis), lilla falsk brom (Brachypodium distachyon) og vild tobak (Nicotiana benthamiana ; ikke-offentliggjorte resultater). Desuden er isolationsmetoden med succes blevet tilpasset plastoglobulerne af cyanobakterier, herunder Synechocystis sp. PCC 6803 og Anabaena sp. PCC 712015, og det udtørrede bladvæv fra opstandelsesplanten, E. nindensis.
Chloroplast plastoglobuler af sundt bladvæv er fysisk forbundet med thylakoidmembranerne16. På trods af denne fysiske kontinuitet opretholder de to kloroplastunderrum forskellige lipid- og proteinsammensætninger, selvom den regulerede udveksling af lipid og protein mellem de to rum er blevet foreslået 2,4,17,18,19. Faktisk er der for nylig blevet foreslået en interessant hemifusionsmodel til handel med neutrale lipider mellem kloroplaster og cytosol19. På grund af den fysiske kontinuitet af plastoglobuler og thylakoider begynder isolationsmetoden med sundt bladvæv med opsamlingen af et pelleteret råt thylakoidpræparat, som efterfølgende sonikeres for at adskille plastoglobulerne fra thylakoiderne, hvilket er i modsætning til metoder, der anvendes til isolering af cytosoliske lipiddråber20 . Ultracentrifugering på en saccharosepude flyder derefter plastoglobulerne med lav densitet op gennem saccharose, hvilket effektivt adskiller dem fra thylakoiderne, kernerne og andet materiale med høj densitet. I modsætning hertil findes plastoglobuler i cyanobakterier såvel som i udtørret bladvæv åbenbart in vivo i en fritflydende form. Derfor involverer deres isolering direkte flydende på en saccharosegradient. Denne artikel demonstrerer isolationsmetoden fra sundt bladvæv og demonstrerer yderligere to variationer, der kan bruges til at isolere plastoglobuler fra udtørret bladvæv eller cyanobakterielle kulturer, hvilket i høj grad udvider den fysiologiske bredde og evolutionære kontekst, hvori plastoglobuler kan studeres.
Isolerede plastoglobuler kan efterfølgende anvendes til et vilkårligt antal downstream-analyser for at undersøge molekylære egenskaber. Vi har brugt de isolerede plastoglobuler fra A. thaliana bladvæv til omfattende proteomisk og lipidomisk analyse under forskellige miljøforhold eller genotyper, hvilket demonstrerer den selektive modifikation af protein- og lipidsammensætning i tilpasning til stress 2,4,21,22. Derudover er de vitro-kinaseassays, der demonstrerer transphosphoryleringsaktivitet forbundet med isolerede plastoglobuler, blevet udført22, de oligomere tilstande af proteinkomponenter er blevet undersøgt under anvendelse af native gelelektroforese 21, og proteasebarberingsassays er blevet udført23.
Den primære fordel ved denne metode er procedurens relative hastighed. Efter vores erfaring kan nedenstående protokoller være fuldt ud afsluttet inden for ca. 4 timer. En alternativ metode til isolering af plastoglobuler fra bladvæv er blevet beskrevet, hvilket muliggør samtidig isolering af andre chloroplastunderrum24. Denne alternative metode giver nogle klare fordele, når kvantitativ sammenligning med de andre kloroplastunderrum er nødvendig eller ønsket. Denne alternative metode er imidlertid også mere kedelig og vil give et signifikant lavere udbytte af isolerede plastoglobuler fra sammenlignelige mængder bladvæv. Når en fokuseret undersøgelse af plastoglobuler er målet, er den metode, der er skitseret her, det optimale valg. Ikke desto mindre kan der indsamles totale blad- og rå thylakoidalikvoter under prøveforberedelsen, og det anbefales stærkt at gøre det for at have referenceprøver til efterfølgende sammenligning.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at minimere fysiologiske/biokemiske ændringer i materialet og beskytte visse foto- og termolabile prenyllipidpigmenter, der er en rig bestanddel af plastoglobuler, er det afgørende at udføre isoleringen ved 4 °C og beskyttet mod lys. Som angivet ovenfor udføres de indledende trin i kølerummet under en sikkerhedslampe ved hjælp af en grøn emitterende pære. De efterfølgende trin, der udføres i laboratoriet, er under dæmpet lys og bruger is eller kølet centrifugering. Af lignende årsager er inkluderingen a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i laboratoriegruppen Lundquist er støttet af bevillinger fra NSF (MCB-2034631) og USDA (MICL08607) til P.K.L. Forfatterne takker Dr. Carrie Hiser (MSU) for støtte i udviklingen af den cyanobakterielle plastoglobule isolationsmetode.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C., Jarvis, R. P. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
