Schaalbare, flexibele en kosteneffectieve zaailingenenting
Summary
Dit protocol beschrijft een robuuste zaailingenbestrijdingsmethode die geen voorafgaande ervaring of training vereist en tegen zeer lage kosten kan worden uitgevoerd met behulp van materialen die gemakkelijk toegankelijk zijn in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie.
Abstract
Zaailingentransplantatie in een vroeg stadium is een populair hulpmiddel geworden in de moleculaire genetica om wortel-scheutrelaties binnen planten te bestuderen. Het enten van zaailingen in een vroeg stadium van de kleine modelplant, Arabidopsis thaliana, is technisch uitdagend en tijdrovend vanwege de grootte en kwetsbaarheid van de zaailingen. Een groeiende verzameling gepubliceerde methoden beschrijft deze techniek met verschillende slagingspercentages, moeilijkheidsgraad en bijbehorende kosten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige procedure om een intern herbruikbaar entapparaat te maken met behulp van siliconenelastomeermix en hoe dit apparaat te gebruiken voor zaailingen. Op het moment van deze publicatie kost elk herbruikbaar entapparaat slechts $ 0,47 aan verbruiksmaterialen om te produceren. Met behulp van deze methode kunnen beginners hun eerste succesvol geënte zaailingen hebben in minder dan 3 weken van begin tot eind. Deze zeer toegankelijke procedure zal laboratoria voor moleculaire genetica van planten in staat stellen om zaailingentransplantatie als een normaal onderdeel van hun experimentele proces vast te stellen. Vanwege de volledige controle die gebruikers hebben bij het maken en ontwerpen van deze entapparaten, kan deze techniek indien gewenst eenvoudig worden aangepast voor gebruik in grotere planten, zoals tomaat of tabak.
Introduction
Enten is een oude tuinbouwtechniek die rond 500 v.Chr. een gevestigde landbouwpraktijk werd1. Het enten van verschillende soorten gewasplanten om de opbrengsten te verbeteren was het eerste gebruik van deze techniek en wordt nog steeds voor dit doel gebruikt. In het afgelopen decennium heeft enten steeds meer aandacht getrokken als een hulpmiddel voor moleculair biologen om langeafstandssignalering in planten 2,3,4,5 te bestuderen. Hoewel het enten van volwassen planten relatief eenvoudig is, is het enten van planten kort na het ontkiemen een uitdaging. Desondanks is het soms nodig om de effecten van langeafstandssignalering te beoordelen in processen zoals plantenontwikkeling, omgevingsreacties en bloei 6,7,8.
Arabidopsis thaliana is om vele redenen vastgesteld als het modelorganisme in de plantenbiologie, waaronder de relatief kleine omvang, waardoor het gemakkelijk in een laboratorium kan groeien. De kleine omvang en kwetsbaarheid van Arabidopsis-zaailingen maakt het enten van jonge zaailingen echter zeer uitdagend. In veel gevallen is uitgebreide hands-on training vereist om met succes zaailingengraften te verkrijgen. Er zijn in de loop der jaren veel methodologische verbeteringen geweest die ideale groeiomstandigheden en nieuwe technieken hebben geïdentificeerd om het slagingspercentage van zaailingenen 9,10,11 te verhogen. De meest recente tool die werd geïntroduceerd, was een Arabidopsis-zaailingenchip, waarmee zelfs onervaren gebruikers aanvaardbare niveaus van entsucces kunnen bereiken12. Hoewel deze vooruitgang de technische barrière van zaailingenenten aanzienlijk heeft verlaagd, is het chipapparaat duur en wordt het aantal grafts dat parallel kan worden uitgevoerd snel onbetaalbaar.
Bovendien kan dit apparaat alleen worden gebruikt voor Arabidopsis-zaailingen met hypocotylafmetingen die vergelijkbaar zijn met zaailingen van het wilde type. Hoewel Arabidopsis de hoeksteensoort is in de wereld van de moleculaire genetica van planten, is recent werk gedaan bij andere soorten met behulp van zaailingen. Voorbeelden hiervan zijn het enten van sojabonen en de gewone boon, tabak tot tomaat en koolzaad tot Arabidopsis, en vervolgens het bemonsteren van beide weefsels op kleine RNA’s13,14. Daarom is een entmethode die voor de meeste laboratoria toegankelijk is en gemakkelijk kan worden aangepast aan een breed scala aan plantensoorten zonder grote technische veranderingen, zeer wenselijk.
Dit protocol beschrijft een methode die gebruik maakt van interne productie van een eenvoudig entapparaat dat de volledige aanpassing van de diameter en lengte van het entkanaal mogelijk maakt om elke morfologie van zaailingen voor de meeste plantensoorten mogelijk te maken. De productie van deze apparaten is zeer betaalbaar en zeer schaalbaar, omdat de enige componenten die nodig zijn siliconenelastomeer, bedrading of slangen van de juiste grootte, een zeer nauwkeurig mes en een container zijn om als mal te dienen. Volgens het hier beschreven entprotocol kunnen gebruikers succesvolle entpercentages van 45% (n = 105) bereiken, vergelijkbaar met eerder gerapporteerde entresultaten10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samenvatting en betekenis
Vorming van een entunie is cruciaal voor een succesvolle enting, die direct en ongestoord contact tussen de onderstam en de telg vereist. De miniatuurgrootte en kwetsbaarheid van zaailingen van kleine planten zoals Arabidopsis maakt het technisch uitdagend om aan deze eis te voldoen. Een techniek die werd ontwikkeld in vroege Arabidopsis-zaailingenentmethoden was om zowel de telg als de onderstam in een korte siliconenbuiskraag te steken om de entverbinding<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Met dank aan Javier Brumos voor de initiële training en begeleiding bij het enten van Arabidopsis zaailingen.
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
