Greffe de semis évolutive, flexible et rentable
Summary
Ce protocole décrit une méthode de greffe de plantules robuste qui ne nécessite aucune expérience ou formation préalable et peut être exécutée à très faible coût en utilisant des matériaux facilement accessibles dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire.
Abstract
La greffe de semis à un stade précoce est devenue un outil populaire en génétique moléculaire pour étudier les relations racine-pousse au sein des plantes. La greffe de semis à un stade précoce de la petite plante modèle, Arabidopsis thaliana, est techniquement difficile et prend beaucoup de temps en raison de la taille et de la fragilité de ses semis. Une collection croissante de méthodes publiées décrivent cette technique avec des taux de réussite, des difficultés et des coûts associés variables. Cet article décrit une procédure simple pour fabriquer un dispositif de greffage réutilisable interne à l’aide d’un mélange d’élastomère de silicone, et comment utiliser ce dispositif pour la greffe de semis. Au moment de la présente publication, la production de chaque dispositif de greffe réutilisable ne coûte que 0,47 $ en matériaux consommables. En utilisant cette méthode, les débutants peuvent avoir leurs premiers plants greffés avec succès en moins de 3 semaines du début à la fin. Cette procédure hautement accessible permettra aux laboratoires de génétique moléculaire des plantes d’établir la greffe de semis comme une partie normale de leur processus expérimental. En raison du contrôle total que les utilisateurs ont dans la création et la conception de ces dispositifs de greffe, cette technique pourrait être facilement ajustée pour une utilisation dans des plantes plus grandes, telles que la tomate ou le tabac, si désiré.
Introduction
Le greffage est une technique horticole ancienne qui est devenue une pratique agricole établie en 500 avant notre ère1. La greffe de différentes variétés de plantes cultivées pour améliorer les rendements a été la première utilisation de cette technique et continue d’être utilisée à cette fin aujourd’hui. Au cours de la dernière décennie, la greffe a attiré de plus en plus l’attention en tant qu’outil permettant aux biologistes moléculaires d’étudier la signalisation à longue distance chez les plantes 2,3,4,5. Bien que la greffe de plantes adultes soit relativement facile, il est difficile de greffer des plantes peu de temps après la germination. Malgré cela, il est parfois nécessaire d’évaluer les effets de la signalisation à longue distance dans des processus tels que le développement des plantes, les réponses environnementales et la floraison 6,7,8.
Arabidopsis thaliana a été établi comme l’organisme modèle en biologie végétale pour de nombreuses raisons, y compris sa taille relativement petite, ce qui le rend facile à cultiver à l’intérieur d’un laboratoire. Cependant, la petite taille et la fragilité des plants d’Arabidopsis rendent la greffe de jeunes plants très difficile. Dans de nombreux cas, une formation pratique approfondie est nécessaire pour réussir à obtenir des greffes de semis. Il y a eu de nombreuses améliorations méthodologiques au fil des ans qui ont permis d’identifier des conditions de croissance idéales et de nouvelles techniques pour augmenter le taux de réussite de la greffe de semis 9,10,11. L’outil le plus récent introduit était une puce de greffe de plantules Arabidopsis, qui permet même aux utilisateurs inexpérimentés d’atteindre des niveaux acceptables de réussite de greffe12. Bien que cette avancée ait considérablement abaissé la barrière technique de la greffe de semis, le dispositif de puce est coûteux et le nombre de greffes pouvant être effectuées en parallèle devient rapidement prohibitif.
De plus, cet appareil ne peut être utilisé que pour les plantules d’Arabidopsis qui ont des dimensions hypocotyles similaires à celles des plantules de type sauvage. Bien qu’Arabidopsis soit l’espèce clé dans le monde de la génétique moléculaire des plantes, des travaux récents ont été effectués sur d’autres espèces en utilisant la greffe de semis. Les exemples incluent la greffe de soja et de haricot commun, le tabac à la tomate et le canola à Arabidopsis, puis l’échantillonnage des deux tissus pour les petits ARN13,14. Par conséquent, une méthode de greffage accessible à la plupart des laboratoires et pouvant être facilement adaptée à un large éventail d’espèces végétales sans modification majeure de la technique est hautement souhaitable.
Ce protocole détaille une méthode qui utilise la production interne d’un dispositif de greffage simple qui permet la personnalisation complète du diamètre et de la longueur du canal de greffage pour s’adapter à toute morphologie de semis chez la plupart des espèces végétales. La production de ces appareils est très abordable et hautement évolutive, car les seuls composants nécessaires sont un élastomère de silicone, un câblage ou un tube de la bonne taille, une lame de haute précision et un récipient pour servir de moule. En suivant le protocole de greffe détaillé ici, les utilisateurs peuvent obtenir des taux de greffe réussis de 45% (n = 105), comparables aux résultats de greffe précédemment rapportés10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Résumé et importance
La formation d’une union de greffe est cruciale pour une greffe réussie, qui nécessite un contact direct et non perturbé entre le porte-greffe et le greffon. La taille miniature et la fragilité des semis de petites plantes telles qu’Arabidopsis rendent techniquement difficile de répondre à cette exigence. Une technique développée dans les premières méthodes de greffe de plantules d’Arabidopsis consistait à insérer à la fois le greffon et le p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci à Javier Brumos pour la formation initiale et les conseils dans la greffe de plants d’Arabidopsis .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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